金黃色葡萄球菌α溶血素基因的克隆、突變和表達及其在細胞玻璃化保存上的初步應用.pdf

1、玻璃化保存技術的發(fā)展和應用,使血清、酶等許多生物制品在常溫下長時間保存成為可能,但此項技術目前僅適用于非細胞性生物材料,對細胞保存效果不佳,所以研制一種新的細胞內(nèi)玻璃化保存方法顯得很有意義.該研究根據(jù)已發(fā)表的金黃色葡萄球菌α溶血素(α-HL)基因序列設計引物,用高保真PCR擴增法從金黃色葡萄球菌標準株1800基因組DNA中擴增出0.9kb的α-HL基因,將其克隆入pGEM-T載體,序列測定結(jié)果顯示,所獲核苷酸序列與已發(fā)表的金黃色葡萄球菌

2、標準株Wood 46 α-HL序列同源性大于99％.為獲得可控孔形成蛋白H5,設計兩對引物來改造α-HL,以H5-5′F和H5-5′R為一對引物,用PCR方法在α-HL 5′-端引入編碼ompA信號肽序列,并將α-HL編碼第130-134號氨基酸的堿基替換為連續(xù)的5個組氨酸(His)序列;另一組以H5-3′F和H5-3′R為一對引物,用PCR方法擴增α-HL 3′-端.將兩段PCR產(chǎn)物分別克隆進pGEM-T載體中,測序鑒定正確后將其切下

3、同時插進pET-30a中相應位點,構建成原核表達載體pET-H5,測序結(jié)果顯示接頭部位和ORF正確.將pET-H5構件轉(zhuǎn)入BL21(DE3)pLysS大腸桿菌中,經(jīng)IPTG誘導后表達分子量正確的35kDa左右的H5蛋白.重組菌超聲波裂解產(chǎn)物上清經(jīng)Ni柱親和層析和酸性緩沖液透析后,獲得單一條帶的表達產(chǎn)物.用純化的H5與兔紅細胞(rRBC)作用,結(jié)果顯示H5蛋白能使rRBC溶血,HC<,50>值為180ng/ml;分子開關試驗結(jié)果表明,H5