清腦通絡(luò)方對(duì)ApoE---鼠腦血管微栓子吞噬的調(diào)控作用和機(jī)制研究.pdf

1、鑒于微血管的管徑小和血流速度緩慢，他們?nèi)菀妆桓鞣N栓子閉塞，如血栓、動(dòng)脈粥樣硬化碎片或循環(huán)中產(chǎn)生的其他碎片栓子等。目前發(fā)現(xiàn)維持血流通暢的機(jī)制包括血流動(dòng)力學(xué)機(jī)制、纖溶系統(tǒng)溶解機(jī)制和血管吞噬外滲栓子機(jī)制，分別導(dǎo)致栓子的洗脫、溶解或外滲。血管吞噬是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種微血管清除栓子的機(jī)制，涉及到血管內(nèi)皮對(duì)栓子的包裹繼而栓子穿過內(nèi)皮細(xì)胞排出到周圍腦組織的過程，血管吞噬外滲栓子使得阻塞的血管實(shí)現(xiàn)再通。研究發(fā)現(xiàn)血管吞噬發(fā)生在小鼠的腦、心臟、腎臟、肺等多

2、個(gè)器官，是一種廣泛存在的清除栓子的機(jī)制，在小鼠腦微血管，血管內(nèi)皮吞噬包裹微栓子最早發(fā)生在微栓塞后1h，卻也會(huì)相應(yīng)的阻礙血流動(dòng)力學(xué)和纖溶系統(tǒng)對(duì)栓子的清除和溶解。間接證據(jù)表明血管吞噬外滲栓子的現(xiàn)象也發(fā)生在人的視網(wǎng)膜微血管。然而血管吞噬的確切機(jī)制仍然未知，整合蛋白、肌動(dòng)蛋白及細(xì)胞骨架重構(gòu)等可能參與到了內(nèi)皮包裹栓子的過程中，而栓子的外排過程則可能涉及到內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑等，CD31、緊密連接蛋白ZO-1、膠原Ⅳ和基質(zhì)金屬蛋白酶（

3、MMPs）等可能參與其中。
　　動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥性血管疾病，它的特點(diǎn)是內(nèi)膜損傷后大量膽固醇等脂質(zhì)沉積產(chǎn)生的粥樣硬化斑塊及增長(zhǎng)的斑塊導(dǎo)致的管腔的縮小，血管內(nèi)皮損傷是AS的一個(gè)重要的病理和始動(dòng)因素。血管內(nèi)皮功能的障礙，可發(fā)生在血管疾病出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)病變之前。鑒于血管吞噬作用是微血管內(nèi)皮清除栓子以維持血流通暢的一種保護(hù)性作用，那么AS時(shí)血管吞噬的功能是否會(huì)受到影響以及受到怎樣的影響，暫時(shí)還缺少相關(guān)的研究。
　　清

4、腦通絡(luò)方是國(guó)醫(yī)大師張學(xué)文教授創(chuàng)立的，原是用于預(yù)防和治療小中風(fēng)的經(jīng)驗(yàn)方，該方由決明子、川芎、赤芍、山楂、丹參、磁石、菊花、葛根等共12種藥物組成，具有清肝和血、化瘀通絡(luò)的作用，因此對(duì)于屬傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)血脈病范疇的疾病有一定的治療作用。既往研究發(fā)現(xiàn)該處方可以降低短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)患者CD41的表達(dá)及TIA的復(fù)發(fā)率，且對(duì)于輕度認(rèn)知功能障礙有一定的改善作用。川芎嗪是該處方中川芎的活性成分，已經(jīng)廣泛的用于腦及心肌缺血的治療，且具有神經(jīng)保護(hù)作用，

5、其可能的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制包括抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用。因AS屬于脈及脈中之血病變繼而產(chǎn)生一系列癥狀，那么清腦通絡(luò)方對(duì)AS時(shí)血管吞噬功能是否有作用呢？因此本研究利用ApoE-/-鼠高脂飼喂復(fù)制AS模型，探討清腦通絡(luò)方對(duì)其血管吞噬的作用及其可能的機(jī)制。
　　目的：
　　1.觀察AS對(duì)血管吞噬功能的影響，以及清腦通絡(luò)方及川芎嗪等對(duì)AS時(shí)血管吞噬栓子外滲的作用。
　　2.觀察清腦通絡(luò)方及川芎嗪對(duì)AS時(shí)血脂水平及血和腦組織氧化應(yīng)激

6、損傷的改善作用。
　　3.鑒于有研究表明緊密連接蛋白ZO-1以及MMP2/9等參與到血管吞噬的過程中且可能對(duì)其具有促進(jìn)作用，觀察AS時(shí)ZO-1、MMPs、CD31等的變化，以及清腦通絡(luò)方和川芎嗪對(duì)ZO-1、MMP2/9、CD31的作用，對(duì)血管吞噬的機(jī)制和清腦通絡(luò)方干預(yù)血管吞噬的機(jī)制進(jìn)行探討。
　　方法：
　　1.動(dòng)物分組及給藥:8-9周的SPF級(jí)雄性ApoE基因敲除小鼠（體重18-20g），適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，給予含脂肪

7、21％(wt/wt)、膽固醇0.15％(wt/wt)的高脂飼料喂養(yǎng)9周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為4組:AS模型組，清腦通絡(luò)方組，川芎嗪組，阿托伐他汀組。體重和年齡匹配的雄性C57BL/6小鼠普通飼料喂養(yǎng)9周作為對(duì)照組。清腦通絡(luò)方組(30g/kg/d)及阿托伐他汀組(3mg/kg/d)小鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥液，川芎嗪組(12mg/kg/d)小鼠接受腹腔注射川芎嗪干預(yù)治療，連續(xù)4周，對(duì)照組及模型組小鼠灌胃給予等體積普通飲用水。
　

8、　2.熒光微栓子制備及頸內(nèi)動(dòng)脈微栓子注入術(shù):從和ApoE基因敲除小鼠相同遺傳背景的C57BL/6小鼠左心室采集動(dòng)脈血制備直徑為8-20μm的血栓栓子，與Texasred-X避光孵育4h以形成熒光共軛。各組小鼠在接受相應(yīng)干預(yù)4周后，均需行頸內(nèi)動(dòng)脈熒光微栓子注入術(shù)（200μl微栓子懸液）。
　　3.血管吞噬率測(cè)定:微栓子注入48h后處死小鼠，處死前15min通過靜脈注射番茄凝集素（FITC標(biāo)記）以標(biāo)記血管。取腦組織制作腦冰凍切片(50

9、μm)，共聚焦顯微鏡成像以定量栓子的滲出。激發(fā)波長(zhǎng)分別為488nm和596nm，雙通道掃描，發(fā)橙紅色熒光的是栓子，發(fā)綠色熒光的是血管，區(qū)別栓子相對(duì)于血管的位置，比較各組血管吞噬外滲栓子率。
　　4.Cobas8000生化分析儀定量測(cè)定各組血脂水平(包括TC、TG、LDL-C、HDL-C)。
　　5.嚴(yán)格按照試劑盒操作說明分別采用WST-1法測(cè)定血液和腦組織中SOD活力，TBA法測(cè)定血液和腦組織MDA的含量，直接法測(cè)血液和腦組

10、織LPO的含量。
　　6.熒光免疫組化法檢測(cè)腦組織中ZO-1、CD31的蛋白表達(dá)。
　　7.免疫印跡法半定量分析腦組織ZO-1、CD31、MMP-2、MMP-9的表達(dá)
　　8.明膠酶譜法測(cè)定腦組織明膠酶的活性。
　　結(jié)果：
　　1.血管吞噬率測(cè)定:頸內(nèi)動(dòng)脈微栓子注入48h后，腦組織冰凍切片計(jì)數(shù)血管吞噬率，與C57BL/6對(duì)照組相比，ApoE-/-鼠高脂飼喂復(fù)制的AS模型血管吞噬栓子外滲率減少，清腦通絡(luò)方組、

11、川芎組血管吞噬栓子外滲率均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.血脂水平測(cè)定:在高脂飼喂13周且給予相應(yīng)干預(yù)4周后，采血檢測(cè)血脂水平，結(jié)果提示AS模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C的水平較對(duì)照組升高，而HDL-C水平降低，表明ApoE基因敲除小鼠通過高脂飼喂產(chǎn)生脂代謝紊亂。清腦通絡(luò)方和阿托伐他汀干預(yù)組小鼠的TC、TG、LDL-C水平較模型組降低;川芎組的TG、LDL-C水平較模型組下降。
　　3.SOD活力、MDA和LP

12、O水平測(cè)定:和對(duì)照組相比，模型組小鼠血液和腦組織中MDA、LPO的含量升高，SOD活力降低。清腦通絡(luò)方和阿托伐他汀可以減少血及腦組織中MDA、LPO的產(chǎn)生，提高SOD的活力。川芎組MDA的水平較模型組降低，SOD活力升高。
　　4.ZO-1、CD31熒光免疫組化及免疫印跡分析:熒光免疫組化結(jié)果提示:和對(duì)照組相比，AS模型組ZO-1和CD31的表達(dá)減少，而川芎嗪、阿托伐他汀鈣和清腦通絡(luò)方可以不同程度上調(diào)ZO-1和CD31的表達(dá)。We

13、stern Blot分析腦組織ZO-1、CD31表達(dá)提示:AS模型組ZO-1和CD31的表達(dá)減少，而清腦通絡(luò)方組和川芎嗪組小鼠腦組織中ZO-1和CD31的蛋白表達(dá)較模型組增加。
　　5.MMP-2、 MMP-9蛋白表達(dá)及明膠酶活性分析:Western-blot分析腦組織MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平提示:同對(duì)照組相比，AS組MMP-2和MMP-9的表達(dá)增多，而清腦通絡(luò)方和川芎嗪可以降低模型組MMP-2和MMP-9的表達(dá)。明膠酶

14、譜結(jié)果亦提示模型組MMP-9的活性增加，而清腦通絡(luò)方和川芎嗪可以降低MMP-9的活性。MMP-2的活性在各干預(yù)組間差異不明顯。
　　結(jié)論：
　　1.AS時(shí)血管吞噬能力降低，表明動(dòng)脈粥樣硬化是血管吞噬能力的影響因素之一。阿托伐他汀、清腦通絡(luò)方及川芎嗪干預(yù)治療可以增加栓子外滲率，提高血管吞噬能力。
　　2.ApoE-/-小鼠由于對(duì)富含膽固醇的脂蛋白清除障礙，因此高脂喂養(yǎng)13周后表現(xiàn)出以高膽固醇血癥為主要特征的脂代謝紊亂。本

15、研究提示清腦通絡(luò)方和阿托伐他汀干預(yù)能夠改善AS時(shí)血脂代謝紊亂。川芎嗪顯示出了一定的調(diào)節(jié)脂代謝的能力。
　　3.AS時(shí)血液及腦組織中產(chǎn)生大量自由基，致使SOD被大量消耗而活力下降，過氧化物質(zhì)MDA和LPO的生成增多，提示血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。清腦通絡(luò)方、阿托伐他汀干預(yù)治療可以減輕內(nèi)皮損傷，提高SOD的活力，降低MDA、LPO的水平;川芎嗪可以提高SOD活力，降低MDA的水平并輕度下調(diào)LPO水平。
　　4.AS時(shí)ZO-1和

16、CD31蛋白表達(dá)降低，內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的屏障功能和BBB的通透性受到破壞，清腦通絡(luò)方和川芎嗪干預(yù)治療可以上調(diào)ZO-1和CD31的表達(dá)，保護(hù)內(nèi)皮緊密連接。
　　5.AS時(shí)MMP-9和MMP-2的蛋白表達(dá)增加，MMP-9的活性增加，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力增強(qiáng)，而清腦通絡(luò)方和川芎嗪干預(yù)治療可以降低明膠酶活性，減輕細(xì)胞外基質(zhì)的降解。
　　6.清腦通絡(luò)方可能通過調(diào)節(jié)AS血脂代謝紊亂、抗氧化應(yīng)激、改善BBB的通透性等機(jī)制以促進(jìn)血管吞噬。