人肝癌細(xì)胞雙鏈RNA文庫的建立與5-氮雜-2＇-脫氧胞苷的抗癌新機制初析.pdf

1、腫瘤的死亡率僅次于心血管疾病，對人類生存與健康構(gòu)成了巨大的威脅。DNA甲基化可以調(diào)控基因的表達(dá)，5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，AZA)作為DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以抑制基因的DNA甲基化，誘導(dǎo)被甲基化的基因表達(dá)。AZ具有明顯的抗腫瘤作用，是一種白血病臨床治療藥物。最新研究表明，AZA抗腫瘤的機制是激活抑癌基因和依賴雙鏈RNA的先天免疫相關(guān)基因。然而，是否存在其他機制，目前尚不清楚。反義RNA是

2、一種與已知基因正義RNA鏈互補的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本，作為一類重要的調(diào)控因子，可在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平參與基因的表達(dá)調(diào)控。雖然不少證據(jù)顯示許多基因具有反義RNA，包括與癌癥相關(guān)的基因，但大部分反義RNA的功能以及反義RNA在癌癥治療中的作用，相關(guān)研究仍相當(dāng)欠缺。本研究首先構(gòu)建了人肝癌細(xì)胞的雙鏈RNA(dsRNA)文庫，然后從中挑選一些具有代表性的dsRNA進(jìn)行更深入的研究，以揭示dsRNA是否介導(dǎo)AZA的抗癌作用。主要的研究方法與結(jié)果如下:

3、r>　　1.雙鏈RNA文庫的構(gòu)建:通過DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑AZA處理人肝癌細(xì)胞，以構(gòu)建雙鏈RNA(Double stranded RNA，dsRNA)文庫。實驗組用溶解于DMSO的AZA處理人肝癌HepG2細(xì)胞，而對照組僅用DMSO處理。處理48小時后分別提取總RNA，經(jīng)DNA酶處理后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，然后進(jìn)行RNA酶處理，體外雜交形成雙鏈DNA，以及單鏈DNA酶處理，最后通過高通量測序獲得dsRNA文庫的序列。數(shù)據(jù)表明，一共

4、篩選到2364個基因的dsRNA，其中實驗組2066個，對照組843個。其中，545個為實驗組與對照組共有（相對于對照組，實驗組有391個為上調(diào)，154個為下調(diào)）。
　　2.通路分析:分析結(jié)果表明，在未經(jīng)AZA處理的HepG2細(xì)胞中，能夠形成dsRNA的基因主要富集在代謝和增殖相關(guān)通路，尤其是‘Protein processing in endoplasmic reticulum’和‘Cell cycle’路徑。而在AZA處理的H

5、epG2細(xì)胞中，dsRNA除了分布在與對照組細(xì)胞共有的路徑外，還分布于其他信號通路，如與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路(Pathway incancer、TGF-beta signaling pathway、pancreatic pathway)、與細(xì)胞生長相關(guān)的通路(Hipposignal pathway)。其中，dsRNA富集最多的是癌癥相關(guān)通路(Pathway in cancer)，其次是亨丁頓舞蹈癥(Huntington's dis

6、ease)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Protein processing in endophsmic reticulum）蛋白修飾相關(guān)通路。
　　3.雙鏈RNA文庫驗證:從上述雙鏈RNA文庫中挑選出一些代表性反義RNA的基因，抑癌基因第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因(PTEN)和先天免疫相關(guān)基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)基因、Ras樣原癌基因B(RALB)和致癌基因MET、癌相關(guān)基因CD44和熱休克蛋白A4(HSPA4)

7、。采用鏈特異性RT-PCR鑒定細(xì)胞中這六個基因是否存在反義RNA。結(jié)果表明這六個基因都存在正、反義RNA的表達(dá)，有力地證明了上述雙鏈RNA文庫構(gòu)建的有效性。
　　4.反義RNA介導(dǎo)AZA的抗癌作用:采用實時熒光定量PCR法分析上述六個基因（PTEN、STAT1、RALB、MET、 CD44、HSPA4）正、反義RNA的表達(dá)情況。結(jié)果表明AZA激活了這六個基因的反義RNA表達(dá)(P＜0.01)。同時，AZA促進(jìn)了抑癌基因PTEN和先天