miRNA在初發(fā)Graves病調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中差異表達(dá)及熒光標(biāo)記miRNA與細(xì)胞非特異結(jié)合的研究.pdf

1、miRNA是一種長(zhǎng)約22nt的非編碼小RNA分子，在幾乎所有生命活動(dòng)和疾病的發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮關(guān)鍵作用。Graves病(GD)是一種最常見(jiàn)的自身免疫性疾病，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是免疫調(diào)控中的關(guān)鍵細(xì)胞。已有研究表明microRNA對(duì)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有提示作用，但是microRNA在Graves病中的研究還很少，在Graves病患者外周血Treg細(xì)胞中的研究更少。另外，在研究microRNA的眾多方法中，熒光標(biāo)記和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是最

2、常用的兩種方法.這兩種方法結(jié)合可以方便的改變細(xì)胞miRNA水平，并示蹤定位miRNA在細(xì)胞內(nèi)的位置，在miRNA的研究中發(fā)揮重要作用。然而，盡管已有大量脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染核酸機(jī)制的研究，但迄今為止對(duì)熒光素標(biāo)記的miRNA分子在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過(guò)程中的特點(diǎn)、機(jī)制和特異性的研究仍然不多。
　　目的：
　　研究microRNA在初發(fā)Graves病Treg中的差異表達(dá)情況及作用，并探討microRNA在外周血Treg中研究較少的原因，以及針對(duì)其中

3、熒光標(biāo)記的microRNA非特異性粘附在細(xì)胞膜表面的現(xiàn)象進(jìn)行深入研究。
　　材料和方法：
　　我們收集45例初發(fā)Graves病患者和61例正常人外周血，用流式細(xì)胞儀分離出CD4+CD25highTreg細(xì)胞，比較Treg細(xì)胞比例和數(shù)目變化情況;再利用實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)方法從CD4+CD25highTreg細(xì)胞中篩選出表達(dá)有差異的microRNA;最后從差異表達(dá)的microRNAs中選出一個(gè)研究其在正常Treg中的功

4、能。另外，對(duì)于在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的Cy5熒光標(biāo)記的microRNA在轉(zhuǎn)染過(guò)程中與細(xì)胞的非特異性結(jié)合這一現(xiàn)象，進(jìn)一步利用不同熒光素（親水性的羧基熒光素FAM和疏水性的碳烯花菁類Cy5）標(biāo)記的不同microRNA用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞（懸浮細(xì)胞K562和貼壁細(xì)胞Hela），并用流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡等技術(shù)深入研究了在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中這種熒光標(biāo)記miRNA與細(xì)胞之間非特異性粘附的普遍性及其可能機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　初發(fā)Graves病患

5、者外周血CD4+CD25highTreg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例和數(shù)目與正常人相比，沒(méi)有明顯差異。而且，單位體積外周血中CD4+CD25highTreg細(xì)胞含量很少。但是，PCR發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，miR28、miR363和miR191在初發(fā)Graves病患者外周血CD4+CD25highTreg中表達(dá)有差異，miR28和miR363高表達(dá)，miR191低表達(dá)。一些在CD4+CD25highTreg中含量很低的microRNA如miR

6、190、miR519e、miR374a等檢測(cè)不出。
　　流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡檢測(cè)顯示Cy5熒光標(biāo)記的microRNA在利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CD4+T細(xì)胞過(guò)程中存在非常明顯的非特異性粘附。
　　非特異性粘附研究結(jié)果表明，在未加入脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的情況下，碳烯花菁類熒光染料Cy5標(biāo)記的miRNA分子能與貼壁的Hela細(xì)胞和懸浮的K562細(xì)胞表面牢固結(jié)合;而羧基熒光染料FAM與K562細(xì)胞表面的結(jié)合也非常明顯，但與Hela細(xì)胞表面的結(jié)

7、合不明顯。加入轉(zhuǎn)染試劑后，由于貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高，與細(xì)胞表而結(jié)合的大部分熒光標(biāo)記miRNA分子都進(jìn)入貼壁的Hela細(xì)胞內(nèi);而絕大部分熒光標(biāo)記miRNA分子仍與懸浮的K562細(xì)胞表面結(jié)合，未進(jìn)入細(xì)胞。而且，破壞靜電相互作用的高鹽buffer不影響上述熒光標(biāo)記miRNA分子與不同細(xì)胞表面的非特異結(jié)合，但破壞疏水相互作用的有機(jī)溶劑可以消除它。這提示熒光標(biāo)記的miRNA可能是通過(guò)疏水相互作用而與細(xì)胞表面非特異結(jié)合。
　　結(jié)論：
　

8、　這些結(jié)果提示，初發(fā)Graves病患者外周血CD4+CD25highTreg比例和數(shù)目沒(méi)有變化，但是Treg中存在部分microRNA差異表達(dá)現(xiàn)象，這些microRNA可能與Graves病患者體內(nèi)免疫失調(diào)有關(guān)。但是，外周血Treg細(xì)胞含量少，而且由于其本身原代懸浮的特性，使microRNA在Treg細(xì)胞中的功能研究受到技術(shù)限制。其中作為研究microRNA在細(xì)胞內(nèi)到底發(fā)揮何種作用時(shí)常用的熒光標(biāo)記microRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的技術(shù)存在熒光染料