Dysferlin肌病miRNA表達模式的改變及miR-708在成肌細胞生長中的作用.pdf

1、【目的】
　　系統(tǒng)檢測miRNA在Dysferlin肌病中的表達，初步探討miRNA與Dysferlin肌病的關系；結合靶基因預測及細胞學實驗，探討miR-708 mimic對成肌細胞的影響。
　　【方法】
　　1.結合臨床表現(xiàn)、HE染色和肌酶特殊染色、免疫組化等方法，篩選Dysferlin肌病病例為實驗組，非特異性改變肌組織為對照組，取部分組織行miRNA芯片分析。
　　2.靶基因預測網站預測作用于DYSF基因

2、的miRNA，結合miRNA芯片結果，選擇與 dysferlin肌病關系密切的miRNA，Taqman探針實時定量 PCR(RT-PCR)檢測其在人肌肉組織及小鼠成肌細胞C2C12增殖和分化過程中的表達。
　　3.合成miR-708 mimic，轉染成肌細胞C2C12，光學顯微鏡下觀察成肌細胞生長分化情況，利用CCK-8檢測miR-708 mimic對C2C12細胞生長增殖的影響，用流式細胞術檢測轉染miR-708 mimic后的

3、增殖期C2C12細胞周期和凋亡情況，RT-PCR、Western blot檢測肌細胞增殖分化相關基因的表達。
　　【結果】
　　1.免疫組化顯示：dysferlin蛋白在正常肌細胞的肌膜上呈線性表達，而在Dysferlin肌病組織中，dysferlin蛋白表達明顯減弱或缺失。光鏡下 Dysferlin肌病組織病理學改變：肌纖維呈輕-重度圓形萎縮伴多量肥大肌纖維形成，散在肌纖維見鑲邊空泡，個別肌纖維溶解壞死，內核纖維明顯增多，

4、間質纖維脂肪組織增生。
　　2.miRNA芯片結果顯示：Dysferlin肌病組織，116個miRNA表達上調，176個miRNA表達下調，部分miRNA表達水平異常與肌病時細胞內各種酶活性的調節(jié)、細胞代謝的調控及MAPK、Wnt信號通路等病理過程相關。結合芯片結果與靶基因預測結果，選擇與DYSF基因關系密切的3個miR(-122、-346、-708)。其中miR-122、-346下調，miR-708上調。
　　3.篩選9例

5、Dysferlin肌病標本進行miRNA檢測，與非特異性改變肌組織對比，miR-122、-346、-708表達均升高（P值分別為0.04，0.04，0.03），其中miR-708在Dysferlin肌病患者肌組織的表達模式與芯片結果一致。
　　4.檢測miR-122、-346、-708在C2C12成肌細胞生長分化過程中的表達，顯示增殖期miR-122、-346、-708表達量較低，分化早期miR-122、-346、-708均升高，

6、但隨著C2C12分化時間的延長，miR-122表達水平基本不變，miR-346、-708表達下調，其中miR-708下調更明顯，達到增殖期水平。
　　5. C2C12細胞轉染miR-708 mimic后，光學顯微鏡下可見成肌細胞增殖受到明顯抑制。CCK-8檢測顯示mimic組C2C12抑制率為（15.40±0.0052）％，（P=0.004），明顯高于NC組（2.87±0.0034）%；流式細胞術結果顯示：轉染miR-708 mi

7、mic后，C2C12細胞周期變化明顯，S期明顯縮短（20.87%），G1期明顯延長(68.64%)，NC組分別為45.66%、42.69%，而細胞凋亡指數(shù)mimic組與NC組無顯著差異；RT-PCR及 Western blot結果顯示：與陰性對照（NC組）相比，轉染miR-708 mimic后MYOD、MYOG、MHC、DYSF蛋白表達水平無明顯變化。
　　【結論】
　　1.Dysferlin肌病可引起多種miRNA表達模式