基于NGS技術(shù)的原發(fā)性免疫缺陷病植入前診斷研究.pdf

1、本論文分為兩個部分:
　　1.基于NGS技術(shù)的原發(fā)性免疫缺陷病分子檢測研究
　　2.原發(fā)性免疫缺陷病NGS-PGH技術(shù)研究
　　第一部分基于NGS技術(shù)的原發(fā)性免疫缺陷病分子檢測研究
　　背景:
　　原發(fā)性免疫缺陷病(Primary immune-deficiency disorders，PID)是機(jī)體防御能力普遍或部分下降的一組臨床綜合征。原發(fā)性免疫缺陷病的病因尚未完全清楚，但普遍認(rèn)為與遺傳有關(guān)。迄今已發(fā)現(xiàn)

2、PID病種近200種。大多數(shù)PID的遺傳形式已明確，幾乎均為單基因遺傳，且多數(shù)為常染色體隱性遺傳，其次為X連鎖隱性和常染色體顯性遺傳。二代測序(Next Generation Sequencing，NGS)的因其高通量、適用范圍廣的有點(diǎn)取得快速發(fā)展，同時目標(biāo)區(qū)域捕獲技術(shù)的發(fā)展，有效降低了NGS技術(shù)對臨床樣本檢測的成本。
　　目的:利用NGS技術(shù)，對3個表型相似的PID患者家系樣本進(jìn)行分子遺傳學(xué)病因研究，明確候選基因致病性，為家庭成

3、員后續(xù)產(chǎn)前診斷或植入前診斷提供遺傳學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　收集3例先證者臨床表型相似的PID患者樣本，多基因目標(biāo)區(qū)域捕獲技術(shù)獲取目的片段，NGS測序，分析PID相關(guān)致病基因，Sanger測序驗證候選基因，候選基因功能分析，明確突變致病性。
　　結(jié)果:
　　三名檢測者目標(biāo)區(qū)域捕獲測序中檢出的所有突變經(jīng)過頻率過濾后，篩選出三名患者的編碼區(qū)非同義變異、插入缺失變異和剪切位點(diǎn)變異，參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(AC

4、MG)序列變異解釋指南檢出有害突變2個。11150051號家系樣本檢出NM_002351.4(SH2D1A): c.251_255delTTTCA突變。11150063號家系樣本檢出NM_000206.2(IL2RG): c.202G＞A雜合變異。31160010號家系未檢測到致病性突變。
　　結(jié)論:
　　1.基于NGS技術(shù)的原發(fā)性免疫缺陷病分子檢測在臨床作為一線檢測手段具有可行性;
　　2.對臨床PID患者直接檢測檢

5、出率較高，檢測結(jié)果能夠為后續(xù)治療和生殖干預(yù)提供依據(jù);
　　3.檢出的NM_002351.4(SH2D1A):c.251_255delTTTCA突變?yōu)槭状伟l(fā)現(xiàn)，豐富了SH2D1A的突變數(shù)據(jù)庫。
　　第二部分原發(fā)性免疫缺陷病NGS-PGH技術(shù)研究
　　背景:
　　PID無特效的治療手段，患兒嬰幼兒死亡率高。偶見使用造血干細(xì)胞移植治療PID的報道，但治療效果和預(yù)后的生活質(zhì)量未知。PID給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，因此

6、建立針對PID的出生缺陷防控體系顯得尤為重要。主要手段包括產(chǎn)前基因診斷和胚胎植入前基因診斷。
　　PGD已經(jīng)成功開展二十多年，但單細(xì)胞水平的單基因病診斷能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了單基因遺傳疾病家系進(jìn)行PGD的需求。隨著全基因組擴(kuò)增技術(shù)的臨床應(yīng)用，WGA產(chǎn)物可進(jìn)行多次、多位點(diǎn)分析，其逐漸成為PGD的重要途徑。
　　NGS技術(shù)可進(jìn)行單堿基分辨的數(shù)據(jù)遺傳分析，目前已用于PGD。NGS的并行特性使得同時檢測多個樣本的多個特定基因組位點(diǎn)成為可能

7、。
　　目的:
　　建立一套基于NGS-PGH技術(shù)的針對PID的PGD體系。
　　方法:
　　本研究利用NGS-PGH技術(shù)對兩個分別攜帶NM_002351.4(SH2D1A):c.192G＞A致病性變異和NM_000022(ADA):c.[646G＞A];[704G＞A]致病性復(fù)合雜合變異的PID家系進(jìn)行PGD診斷。經(jīng)胚胎活檢、全基因組擴(kuò)增、多個目標(biāo)位點(diǎn)的多重PCR擴(kuò)增獲得目標(biāo)序列、NGS測序，獲取目標(biāo)區(qū)域上下游

8、SNP數(shù)據(jù)。以標(biāo)記SNP作為遺傳標(biāo)記對目標(biāo)基因進(jìn)行單體型分析，結(jié)合突變位點(diǎn)直接檢測結(jié)果，獲得未攜帶突變位點(diǎn)胚胎。結(jié)合胚胎形態(tài)學(xué)評分，選擇合適胚胎移植，妊娠后孕中期抽取羊水細(xì)胞的檢測證明PGD檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　結(jié)果:
　　共分析了10個樣本，包括7個胚胎樣本。NGS測序10個樣本共獲得了0.47G的數(shù)據(jù)，單個樣本獲得112有效的SNP位點(diǎn)。單體型分析ADA基因上下游有效的SNP位點(diǎn)，胚胎2未攜帶ADA基因突變的單倍型，結(jié)