人骨軟骨組織冷凍保存效果及組織庫(kù)建立.pdf

1、目的:
　　 按照AATB標(biāo)準(zhǔn),應(yīng)用慢速梯度降溫冷凍保存骨軟骨標(biāo)本,觀察保存后軟骨細(xì)胞存活率及細(xì)胞活性的變化,并建立骨軟骨組織庫(kù),初步應(yīng)用于臨床,為骨軟骨移植物臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 年齡在15-45歲之間的捐獻(xiàn)者(山東省千佛山醫(yī)院臨床腦死亡的病人,無(wú)關(guān)節(jié)病損),死前做血尿及其他體液常規(guī)檢查符合捐獻(xiàn)條件,于死亡后12小時(shí)內(nèi),無(wú)菌條件下應(yīng)用Arthrex關(guān)節(jié)軟骨移植器械垂直于膝關(guān)節(jié)股骨髁與脛骨平臺(tái)關(guān)

2、節(jié)面切取直徑為6mm、8mm、10mm,骨柱長(zhǎng)約10-15mm的圓柱形骨軟骨塊,共200枚。經(jīng)10％DMSO處理后無(wú)菌獨(dú)立包裝,行慢速梯度降溫至-80℃,保存入-80℃深低溫冰箱,建立骨軟骨組織庫(kù)。分別在保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年時(shí)隨機(jī)抽取10枚標(biāo)本行胎盤(pán)藍(lán)染色檢測(cè)軟骨細(xì)胞存活率,MTT法檢測(cè)軟骨細(xì)胞活性;10枚做組織學(xué)和組織化學(xué)染色觀察軟骨細(xì)胞組織形態(tài)和代謝活性變化。將各時(shí)間段保存標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果與新鮮組對(duì)照,評(píng)價(jià)保存效果,并在冷

3、凍保存早期選取6枚標(biāo)本應(yīng)用于臨床治療3例患者膝關(guān)節(jié)軟骨缺損,平均隨訪2個(gè)月,評(píng)價(jià)臨床效果。
　　 結(jié)果:
　　 1、軟骨細(xì)胞存活率的變化新鮮對(duì)照組軟骨細(xì)胞存活率為94.80±4.59,應(yīng)用梯度降溫冷凍保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年時(shí),細(xì)胞存活率分別為66.95±9.98、58.11±9.11、43.7±8.37、29.21±5.03,實(shí)驗(yàn)組與新鮮對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),各保存時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組組間兩兩比較均

4、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。即深低溫冷凍保存對(duì)軟骨細(xì)胞存活率的影響具有動(dòng)態(tài)時(shí)間依從性。
　　 2、關(guān)節(jié)軟骨PG的變化新鮮對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨PG含量豐富,番紅O染色為紅橙色,經(jīng)梯度降溫冷凍保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年時(shí),番紅O染色逐漸變淺,各組淺、中、深層平均IOD值(表1),各實(shí)驗(yàn)組與新鮮對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),各保存時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),即深低溫冷凍保存對(duì)軟骨PG的影響有時(shí)

5、間依從性。
　　 3、軟骨細(xì)胞活性新鮮對(duì)照組OD值為0.65±0.03,經(jīng)階梯降溫冷凍保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年時(shí),OD值分別為0.42±0.04、0.29±0.02、0.21±0.03、0.16±0.04,各實(shí)驗(yàn)組與新鮮對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),各保存時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),即深低溫冷凍保存對(duì)軟骨細(xì)胞活性的影響有時(shí)間依從性。
　　 4、無(wú)菌操作取材的骨軟骨標(biāo)本經(jīng)慢速

6、梯度降溫至-80℃冷凍保存1月-1年,包裝完好,各保存時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取標(biāo)本行細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果均為陰性;臨床應(yīng)用冷凍保存的6枚標(biāo)本治療3例關(guān)節(jié)軟骨缺損,術(shù)后MRI檢查均可見(jiàn)移植骨與宿主骨融合,Brittberg-Peterson功能評(píng)分較術(shù)前明顯降低,顯示早期移植效果滿意。
　　 結(jié)論:
　　 1、深低溫保存對(duì)關(guān)節(jié)軟骨活性的影響具有動(dòng)態(tài)的時(shí)間依從性。隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng),關(guān)節(jié)軟骨活性會(huì)逐漸降低;低溫導(dǎo)致軟骨被凍傷是客觀存在的。

7、
　　 2、梯度降溫深低溫冷凍保存可操作性強(qiáng),能使骨軟骨移植物細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng),建立骨軟骨組織庫(kù)具有可行性。
　　 3、應(yīng)用組織庫(kù)保存的骨軟骨移植物治療關(guān)節(jié)軟骨缺損手術(shù)取得了初步臨床效果。
　　 意義:青少年運(yùn)動(dòng)傷導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療一直是個(gè)難題,骨軟骨移植是公認(rèn)的較為理想的治療方法。由于供體來(lái)源的有限,如何長(zhǎng)時(shí)間的保存有活性的軟骨移植物成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。目前國(guó)外已開(kāi)展了冷凍保存骨軟骨組織方法與臨床應(yīng)用研究