糖尿病對(duì)小鼠腹主動(dòng)脈瘤組織蛋白酶S及胱抑素C表達(dá)的影響.pdf

1、目的：大量的流行病學(xué)證據(jù)表明，糖尿病是腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)的保護(hù)性因素，其機(jī)制尚不明確。近年研究結(jié)果顯示，組織蛋白酶S(Cathepsin S)是導(dǎo)致腹主動(dòng)脈瘤血管基質(zhì)重塑的關(guān)鍵因子之一，Cathepsin S及其內(nèi)源性抑制物胱抑素C(Cystatin C)在AAA的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。AAA瘤壁內(nèi)Cathepsin S含量增高而胱抑素C缺乏，Cathepsin S能夠誘導(dǎo)主動(dòng)脈細(xì)胞外

2、基質(zhì)降解、平滑肌細(xì)胞凋亡、炎癥細(xì)胞聚集和微血管生成，最終促進(jìn)AAA的產(chǎn)生和增長(zhǎng)。
　　然而糖尿病相關(guān)領(lǐng)域的研究卻發(fā)現(xiàn)，糖尿病動(dòng)物模型中Cathepsin S的表達(dá)及活性受到抑制，糖尿病人群的血漿Cystatin C水平也高于非糖尿病人群。這種相反作用能否是糖尿病對(duì)AAA的保護(hù)機(jī)制，目前暫缺乏研究。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)構(gòu)建糖尿病及AAA的小鼠模型，探討糖尿病對(duì)AAA組織中Cathepsin S及CystatinC表達(dá)的影響，以期尋找糖尿病對(duì)

3、AAA的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：
　　將16只載脂蛋白E基因缺陷(ApoE-/-)的C57/BL6小鼠隨機(jī)分入AAA組和DM+AAA組并建立相應(yīng)動(dòng)物模型。DM+AAA組小鼠連續(xù)5天腹腔注射鏈脲佐菌素溶液(50mg/kg)誘發(fā)糖尿病，AAA組腹腔注射等量緩沖液作為對(duì)照。21天后測(cè)血糖大于16.7mmol/L（300mg/dL）者視為糖尿病模型建立成功。隨后對(duì)兩組小鼠同時(shí)構(gòu)建AAA模型，應(yīng)用植入式膠囊滲透壓泵將血管緊張素Ⅱ以100

4、0ng·kg-1·min-1的速度持續(xù)灌注28天。灌注前后分別通過(guò)B超測(cè)量最大腹主動(dòng)脈直徑，腹主動(dòng)脈直徑增大1.5倍者視為腹主動(dòng)脈瘤模型建立成功。
　　AAA造模成功后處死小鼠，并采集小鼠血漿及AAA組織標(biāo)本。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)比較兩組小鼠CystatinC的血漿水平差異。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Western-Blotting)、免疫組化觀察兩組小鼠AAA組織中Cystati

5、n C及Cathepsin S在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)差異。通過(guò)Weigert彈力纖維染色法觀察兩組小鼠AAA組織中彈力纖維的破壞程度。
　　結(jié)果：
　　AAA造模前，DM+AAA組與AAA組的腹主動(dòng)脈最大直徑無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.68±0.04mm vs0.70±0.04mm)。AAA造模后，DM+AAA組的腹主動(dòng)脈瘤最大直徑明顯小于AAA組（1.13±0.14mm vs1.35±0.26mm）。ELISA結(jié)果顯示，DM

6、+AAA組Cystatin C的血漿水平高于AAA組(1347.19±340.12pg/ml vs1060.17±153.55pg/ml)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。qRT-PCR和Western-blotting結(jié)果顯示，與AAA組相比，DM+AAA組Cystatin C在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均上調(diào)，而Cathepsin S在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化結(jié)果顯示，Cystatin C在DM+AAA組瘤壁中

7、的表達(dá)較AAA組增加，Cathepsin S在DM+AAA組瘤壁中的表達(dá)較AAA組降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Weigert彈力纖維染色結(jié)果顯示，與AAA組相比，DM+AAA組的彈力纖維斷裂數(shù)量明顯減少、破壞程度降低(2.00±0.76 vs2.88±0.64)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　本研究表明糖尿病能夠增高小鼠血漿及AAA組織中Cystatin C含量，并抑制AAA組織中Cathepsin S的表達(dá)，降低腹