以TCF為抗癌化合物靶標的分子機制研究.pdf

1、目的：以TCF轉(zhuǎn)錄子為靶點篩選具有Wnt通路抑制活性的化合物，并開展其作用機制研究。
　　方法：將TCF轉(zhuǎn)錄子Bindingsite克隆到帶熒光素酶基因的表達載體，轉(zhuǎn)染到293T工具細胞中，24h后接種到96孔板中同時加入10％的Wnt3A細胞上清液，12h后加入化合物，以DMSO組為空白對照。藥物作用12h后離心去掉細胞液，加入熒光素酶裂解液，置于酶標儀中讀取數(shù)據(jù)，每個樣本重復3次。將乳腺癌細胞 MDA-MB231，白血病細胞

2、K562、HEL，黑色素瘤細胞 WM9，胰腺癌細胞SW480等，接種于96孔板中，每孔約8000個細胞，加入活性化合物，72h后離心去掉細胞液，加入MTT液作用4h，離心去掉MTT液，每孔加入200μlDMSO，水平搖床搖晃至完全溶解，酶標儀下490nm處檢測。將乳腺癌MDA-MB231細胞接種于6孔板中，加入具有細胞毒性化合物作用24h，按照試劑盒說明書操作，流式細胞儀下檢測周期凋亡。將乳腺癌細胞 MDA-MB231接種于6孔板中，加

3、入具有細胞毒性化合物作用24h，提取RNA，照試劑盒說明書PCR儀中檢測相關(guān)基因表達量，同上所述接種細胞，加入活性化合物作用12h，Western blot檢測相關(guān)蛋白表達。
　　結(jié)果：熒光素酶化合篩選系統(tǒng)篩選了1500余個化合物，其中2個化合物A661、A665能夠抑制轉(zhuǎn)錄子TCFBS基因表達，提示A661、A665能夠抑制Wnt通路；經(jīng)細胞毒性實驗（MTT法）檢測發(fā)現(xiàn)，這兩個化合物對乳腺癌細胞MDA-MB231，白血病細胞K5

4、62、HEL，黑色素瘤細胞WM9及結(jié)腸癌細胞SW480有較強的細胞毒性，通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn) A661能夠明顯引起乳腺癌細胞MDA-MB231發(fā)生凋亡，A665能夠引起白血病細胞 K562發(fā)生凋亡，A661及A665能夠引起白血病細胞HEL發(fā)生凋亡，A661及A665能夠引起乳腺癌細胞MDA-MB231 S/G2期阻滯；進一步的機理研究發(fā)現(xiàn)A661及A665能夠在MDA-MB231中抑制Wnt通路靶蛋白β-catenin、cyclin

5、 D1的表達，抑制Wnt通路靶基因Axin2的mRNA表達，并激活GSK3蛋白的磷酸化，磷酸化的GSK3能夠降解Wnt通路靶蛋白β-catenin表達，從而阻滯Wnt通路；體內(nèi)實驗結(jié)果顯示化合物A661及A665能夠延長Friend病毒引起的白血病小鼠存活時間，增加血紅細胞數(shù)量，改善貧血癥狀；研究還發(fā)現(xiàn)：A661及A665為Fli-1的抑制劑，能夠抑制紅白血病關(guān)鍵調(diào)控因子Fli-1表達，促進Fli-1下游負調(diào)控靶基因的表達。