嗜鹽古生菌rad25基因上游序列在三域生物中的啟動子功能研究.pdf

1、利用大腸桿菌啟動子探針載體pKK232-8，從極端嗜鹽古生菌中基因組DNA分離得到一個能在真細菌域(大腸桿菌)中具有啟動子活性的RM10DNA片段。DNA序列查詢發(fā)現它包含了嗜鹽古生菌rad25基因部分編碼序列和上游調控序列；DNA序列分析表明該片段既含有類似嗜鹽古生菌啟動子和真核生物RNA聚合酶Ⅱ啟動子的TATAbox特征序列等，也含有典型的真細菌啟動子-35和-10區(qū)特征序列。 在嗜鹽古生菌中，以β-半乳糖苷酶基因(bgaH

2、)為報告基因，構建了RM10片段和報告基因相融合的重組質粒，通過檢測報告基因轉錄的mRNA和表達的酶活性，證明了RM10DNA片段的確具有啟動子功能。通過構建了一系列RM10不同缺失片段融合到報告基因上游的重組質粒，檢測了RM10不同缺失片段的啟動子活性大小，在嗜鹽古生菌中濃縮定位了RM10片段中對于啟動子活性有影響的重要功能區(qū)，結果表明：rad25基因5'端上游含有TATAbox和BRE特征序列(-305至-130)是片段中對啟動子活

3、性有影響的關鍵功能區(qū)。 在大腸桿菌中，利用氯霉素抗性基因(cat)作為報告基因，構建了RM10片段和報告基因的融合質粒，通過檢測報告基因的轉錄和抗性水平，結果表明RM10片段在大腸桿菌具有啟動子功能。通過構建缺失片段插入報告基因上游的重組質粒，在大腸桿菌對RM10片段進行了缺失突變分析，確定了rad25基因5'端上游序列包含TATAⅠ特征序列的-305～-250區(qū)段是影響RM10片段在大腸桿菌的啟動子活性關鍵部分。結果說明rad

4、25基因5'端上游序列在大腸桿菌有啟動子功能和在嗜鹽古菌中有啟動子功能在序列上既存在差異，同時又是相互聯系的。 在釀酒酵母菌和哺乳動物細胞中，分別利用G418抗性基因(neor)、綠色熒光蛋白基因(egfp)、熒光素酶基因(Luc+)為報告基因，構建各種RM10片段和報告基因相融合的重組質粒，通過檢測報告基因表達的抗性水平、綠色熒光和酶活性，證實RM10在真核生物中具有啟動子功能。通過構建缺失片段融合到報告基因上游的重組質粒，對

5、RM10片段進行了缺失突變分析，結果表明：在釀酒酵母中，含有TATAⅣ和多個GGCGGbox特征序列的-1767～-889區(qū)段對RM10片段在酵母菌中具有強啟動子活性很重要，包含TATAⅢ特征序列的-889～-403區(qū)段是RM10片段在酵母菌中有啟動子活性的基本的區(qū)段，包含TATAⅡ特征序列的-403～-329區(qū)段對RM10片段在酵母菌中有啟動子活性有一定影響。在動物細胞中，含有TATAⅢ、TATAⅡ和TATAⅠ特征序列的+1～-889

6、區(qū)段啟動子活性最大，含有TATAⅢ特征序列的-889～-403區(qū)段、TATAⅡ特征序列的-403～-305區(qū)段、和TATAⅠ特征序列的-305～-197區(qū)段每段都對RM10片段在細胞中有啟動子活性都有非常重要的影響。在每種真核細胞中，其啟動子活性與推測的真核啟動子特征序列基本上是一致的，在不同的真核細胞中，其主要功能區(qū)既存在差異又是相互聯系的。 將精確、靈敏、快捷的微量量熱方法應用于啟動子的結構與功能研究，進一步證實了RM10片