DNA Shuffling技術提高干擾素比活性的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:DNAshuffling技術可以定向進化干擾素，獲得比rhIFN-α2b標準品更高比活的干擾素。本實驗利用DNase(I)酶切、無引物PCR、有引物PCR、目的基因與克隆基因pUC19連接、雙酶切鑒定，轉化至DH5α感受態(tài)細胞、陽性克隆的篩選、測序正確的基因與表達載體pET30a連接、轉化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞以及誘導表達目的蛋白、細胞裂解、包涵體的純化、洗滌與裂解、目的蛋白的純化測活等一系列技術手段獲得比rhIFN-α2

2、b更高比活的干擾素。方法:rhIFN-α2b基因與Infergen基因用DNase(I)酶切成30-50bp小片段，回收之后進行無引物PCR重聚和有引物PCR擴增基因。將重組基因連接到載體pUC19中，轉化至DH5α并挑選陽性克隆測序。將測序正確的突變基因連接到載體pET30a中并轉化至BL21(DE3)中，誘導蛋白表達、SDS-PAGE凝膠電泳和Westernblot分析。經過表達細胞誘導、細胞裂解、包涵體變性、復性和單克隆抗體親和層

3、析之后，最后獲得高純度與高活性的重組干擾素。結果:把10個連接到pUC19載體上的基因片段通過測序顯示7段載體上的基因沒有發(fā)生改變，分別是5段Infergen基因和2段rhIFN-α2b基因。3段基因序列發(fā)生了改變，包括2段基因發(fā)生了移碼突變，1段基因為正常突變干擾素基因，對重組基因表達的干擾素測活得到的比活值為5.8×108IU/mg，而rhIFN-α2b標準品比活大約為1.2×108IU/mg，比活結果提高近5倍。結論:實驗結果證明

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