PCR-SSP基因分型技術(shù)在紅細(xì)胞血型鑒定中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的:血型通常被限定為紅細(xì)胞表面抗原,即一般所稱的血型是指紅細(xì)胞表面的抗原。目前共發(fā)現(xiàn)血型近400個(gè),分屬于30個(gè)血型系統(tǒng)。ABO、Rh等血型系統(tǒng)是目前最具有臨床意義的血型系統(tǒng)。ABO血型系統(tǒng)的抗原決定簇共有4種類型,由單糖經(jīng)轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移到特定核心多糖鏈的末端生成,分別構(gòu)成AB抗原、A抗原、A1抗原以及B抗原的抗原表型。Rh血型系統(tǒng)是人類紅細(xì)胞30個(gè)血型系統(tǒng)中最為復(fù)雜的1個(gè)抗原系統(tǒng),在臨床輸血中的重要性僅次于ABO血型。Rh血型系統(tǒng)包括5

2、0個(gè)抗原,與臨床密切相關(guān)的抗原主要有D、C、c、E和e等抗原,其中D抗原具有很強(qiáng)的免疫原性,可導(dǎo)致嚴(yán)重的胎兒和新生兒溶血病(HDFN)。目前臨床實(shí)驗(yàn)室最常用的血型鑒定方法是血凝試驗(yàn)和微柱凝膠試驗(yàn)。近年來(lái)隨著醫(yī)學(xué)生物技術(shù)的進(jìn)展,建立了一些更為快速、結(jié)果更易判定的血型檢測(cè)方法。流式細(xì)胞技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)已用于ABO血型鑒定。前者在細(xì)胞分型方面具有速度快、靈敏度高、特異性好,結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì),特別適合應(yīng)用于ABO血型亞型的快速鑒定

3、；后者則能方便用于檢測(cè)唾液中血型物質(zhì)。然而,這些血型檢測(cè)技術(shù)與傳統(tǒng)的凝集實(shí)驗(yàn)一樣都是基于抗原抗體反應(yīng),在ABO亞型、血型抗原減弱反應(yīng)、抗體消失、獲得性B的鑒定、Cis-AB、類孟買型、血型嵌合體等正反定型不符情況下,仍不能準(zhǔn)確鑒定血型。PCR-SSP基因分型技術(shù)克服了血型血清學(xué)方法的限制,是一種比較簡(jiǎn)便的分型方法,為臨床解決了一些疑難血型鑒定問題,在國(guó)內(nèi)外輸血醫(yī)學(xué)實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用。我國(guó)對(duì)ABO血型基因的研究自上世紀(jì)90年代中期開始,有

4、關(guān)的實(shí)驗(yàn)室使用多重PCR、PCR-SSP、PCR-RFLP、序列測(cè)定、基因克隆和單倍體分型等技術(shù)對(duì)我國(guó)人群ABO基因遺傳多態(tài)性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)了一些新的單核苷酸點(diǎn)突變,初步揭示出中國(guó)人群ABO等位基因有著自己的特點(diǎn)。由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室收集樣本量的有限,均未能系統(tǒng)揭示出中國(guó)人群血型基因分子遺傳的基礎(chǔ)。本研究擬選取ABO、Rh、Kidd三個(gè)血型系統(tǒng),建立適合本地區(qū)實(shí)際情況使用的PCR-SSP基因分型技術(shù),調(diào)查基因頻率,鑒定疑難血型；研究建立適合

5、本地區(qū)的RhD(-)個(gè)體鑒別、篩檢策略。
　　 材料:隨機(jī)選擇134例樣本參與A、B、O基因頻率調(diào)查,其中再選擇36份參與Jka、Jkb基因頻率調(diào)查。樣本來(lái)源為肇慶市2009年3月至4月的無(wú)償獻(xiàn)血者。疑難血型樣本8例,Rh D陰性樣本2例,其血清學(xué)表型分別為Ccdee、ccdee,樣本來(lái)源為肇慶市中心血站無(wú)償獻(xiàn)血者及肇慶地區(qū)各醫(yī)院疑難血型及疑難配血送檢樣本。
　　 方法:
　　 (1)對(duì)134例獻(xiàn)血者樣本采用正、

6、反定型試驗(yàn)進(jìn)行ABO血型鑒定,同時(shí)采用PCR-SSP法進(jìn)行基因分型實(shí)驗(yàn)；
　　 (2)對(duì)36份獻(xiàn)血者樣本采用抗人球蛋白方法檢定其紅細(xì)胞表面的Jka、Jkb抗原,同時(shí)采用PCR-SSP法進(jìn)行基因分型實(shí)驗(yàn)；
　　 (3)采用抗-D(IgM+IgG)在鹽水介質(zhì)中初篩,然后通過經(jīng)典間接抗球蛋白試驗(yàn)(IAT)確認(rèn),篩檢出2例Rh D陰性表型,使用PCR-SSP基因分型方法對(duì)2例Rh D陰性表型樣本進(jìn)行Rh-C、c、D、E、e以及R

7、hD外顯子基因鑒定；
　　 (4)對(duì)8例ABO疑難血型樣本采用正、反定型試驗(yàn),吸收放散試驗(yàn)等進(jìn)行血清學(xué)分型,采用PCR-SSP法進(jìn)行基因分型實(shí)驗(yàn)；
　　 (5)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù),ABO血型由計(jì)數(shù)方法得到的等位基因頻率與Bemstrein公式得到的基因頻率的比較采用擬合優(yōu)度檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 (1)134名個(gè)體血型基因分型結(jié)果均與血清

8、學(xué)分型結(jié)果相符,在中國(guó)人群中小樣本調(diào)查得出A、B、O等位基因的頻率(計(jì)數(shù)方法)分別為20.15％、15.67％、64.18％,該數(shù)據(jù)與采用Bemstein公式求得A、B、O等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=1.301,P=0.522)。Jka、Jkb基因的頻率分別為Jka=0.4167(30/72),Jkb=0.5833(42/72)。
　　 (2)PCR-SSP基因分型方法在鑒別RhD陽(yáng)性以及真正意義上的RhD陰性個(gè)體中,與

9、血清學(xué)結(jié)果相一致,但在鑒別血清學(xué)表型為Ccdee等C抗原陽(yáng)性的個(gè)體時(shí),基因分型結(jié)果與血清學(xué)結(jié)果出現(xiàn)不相符的情況；
　　 (3)8例疑難血型樣本僅憑血清學(xué)分型均難以確定血型。樣本1與樣本3經(jīng)正定型均檢不出A抗原,但吸收放散實(shí)驗(yàn)證實(shí)紅細(xì)胞表面存在A抗原；樣本2在顯微鏡下可見紅細(xì)胞與抗-A有弱凝集,同時(shí)吸收放散實(shí)驗(yàn)證實(shí)紅細(xì)胞存在A抗原；樣本4與樣本5存在意外抗體干擾反定型實(shí)驗(yàn),血清學(xué)定型為A型；樣本6紅細(xì)胞與抗-A在肉眼下呈現(xiàn)凝集,但

10、強(qiáng)度很弱,判定為A型;樣本7在顯微鏡下僅見紅細(xì)胞與抗-B有弱凝集,吸收放散實(shí)驗(yàn)證實(shí)紅細(xì)胞表面存在B抗原；樣本8經(jīng)正定型檢不出B抗原,吸收放散實(shí)驗(yàn)證實(shí)紅細(xì)胞表面存在B抗原。基因分型試驗(yàn)顯示,1至6號(hào)樣本均為A/O,7、8號(hào)樣本為B/O,基因分型所得的結(jié)果與血清學(xué)分型結(jié)果相符合。
　　 結(jié)論:
　　 (1)選取ABO、Rh、Kidd三個(gè)血型系統(tǒng)為例子,建立了適合本地區(qū)實(shí)際使用的基因分型方法,小樣本研究表明PCR-SSP基因分

11、型方法能準(zhǔn)確、有效對(duì)ABO、Rh、Kidd等血型進(jìn)行正確定型。
　　 (2)建立了適合本地區(qū)實(shí)際使用的RhD陰性個(gè)體的鑒定策略。
　　 (3)應(yīng)用PCR-SSP基因分型方法對(duì)ABO、Kidd血型系統(tǒng)進(jìn)行了小樣本基因頻率調(diào)查,肇慶地區(qū)人群中A、B、O基因頻率(計(jì)數(shù)方法)分別為20.15％、15.67％、64.18％,Jka、Jkb的頻率分別為Jka=0.4167(30/72),Jkb=0.5833(42/72)。由基因分型