RBV聯(lián)合IFN-β治療HCV和miRNAs表達(dá)關(guān)系的體外研究.pdf

1、背景與目的
　　 盡管已研究數(shù)十年,丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)持續(xù)感染仍然是全球一個(gè)主要的健康問(wèn)題。肝特異性微小核糖核酸122(miRNA-122,miR-122)在體外和體內(nèi)均可促進(jìn)HCV復(fù)制和翻譯,提示miR-122與HCV發(fā)病機(jī)制有關(guān)。然而對(duì)干擾素(interferon,IFN)能否通,過(guò)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞miR-122或其他miRNAs(包括miR-196b,miR-296,miR-351,miR

2、-431和miR-448)來(lái)抑制HCV存在爭(zhēng)議。此外,臨床上利巴韋林(ribavirin,RBV)能明顯提高IFN的抗HCV療效,但機(jī)制仍未清楚。由于RBV能抑制細(xì)胞增殖、減少GTP池和干擾核酸代謝,因此RBV有可能影響細(xì)胞miRNAs的表達(dá),及隨后的協(xié)同IFN抗HCV。在這項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)中,主要是研究IFNβ聯(lián)合RBV治療HCV與肝細(xì)胞miR-122或其他miRNAs表達(dá)的關(guān)系,探討這兩種藥物新的可能作用機(jī)制,對(duì)目前HCV的抗病毒治療和療

3、效抵抗的宿主機(jī)制均有重要的指導(dǎo)意義。
　　 方法：
　　 1.莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)Huh7細(xì)胞miRNAs的檢測(cè),目的是建立一種簡(jiǎn)便檢測(cè)人肝癌細(xì)胞株Huh7細(xì)胞miRNAs的實(shí)時(shí)定量PCR方法:提取Huh7細(xì)胞總RNA,通過(guò)miRNA芯片檢測(cè)出3個(gè)分別代表高、中、低拷貝的miR-122、24、146a,并用磷32標(biāo)記的Northern印跡證實(shí)。然后分別采用poly(A)加尾和莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR方法

4、檢測(cè)上述3個(gè)miRNA。用Quantity One軟件和7500系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析。
　　 2.IFNβ聯(lián)合RBV治療對(duì)Huh7細(xì)胞miR-122和其他miRNA的表達(dá)影響:Huh7細(xì)胞分別經(jīng)過(guò)RBV(12.5μM,25μM or50μM)處理3d、IFNβ(10 U/ml,100 U/ml,or1000 U/m1)處理2h～16h,單用或聯(lián)合用。噻唑蘭(MTT)法檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線(xiàn),RT-PCR法檢測(cè)干擾素誘導(dǎo)基因54(ISG54)

5、表達(dá),莖環(huán)結(jié)構(gòu)實(shí)時(shí)PCR和地高辛標(biāo)記的Northern印跡檢測(cè)miR-122和miR-196b表達(dá)變化。miRNA芯片檢測(cè)miRNA表達(dá)譜變化。數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn)。
　　 3.IFNβ聯(lián)合RBV治療對(duì)含有HCV亞復(fù)制子的Huh7細(xì)胞miR-122和其他miRNA的表達(dá)影響:復(fù)制子細(xì)胞分別經(jīng)過(guò)RBV(12.5μM,251μM or50μM)處理3d、IFNβ(10 U/ml,100 U/ml,or100

6、0 U/ml)處理2h～16h,單用或聯(lián)合用。噻唑蘭(MTT)法檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線(xiàn),RT-PCR法檢測(cè)干擾素誘導(dǎo)基因54(ISG54)和HCV RNA表達(dá),莖環(huán)結(jié)構(gòu)實(shí)時(shí)PCR和地高辛標(biāo)記的Northern印跡檢測(cè)miR-122和miR-196b表達(dá)變化。miRNA芯片檢測(cè)miRNA表達(dá)譜變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.Huh7細(xì)胞芯片miR-122、24、146a的信號(hào)強(qiáng)度分別為2201.49、410.20、4.70,磷32

7、標(biāo)記的Northern印跡證實(shí)相對(duì)表達(dá)量分別為0.0383、0.0249、0.0001。poly(A)加尾逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR方法只能檢測(cè)出miR-122,而莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)miR-122、24、146a均能檢測(cè)出,其相對(duì)于U6平均dCt值分別為2.5、5.8、12.1,與miRNA芯片和Northern印跡結(jié)果一致。
　　 2.IFNβ聯(lián)合RBV治療對(duì)Huh7細(xì)胞miR-122和其他miRNA的表達(dá)影響:R

8、BV能以劑量依賴(lài)方式分別抑制Huh7生長(zhǎng),IFNβ能以劑量和時(shí)間依賴(lài)方式誘導(dǎo)細(xì)胞ISG54和miR-196b表達(dá),聯(lián)合治療沒(méi)有協(xié)同效果。IFNβ和RBV均能輕微抑制細(xì)胞miR-122水平,聯(lián)合治療有輕微協(xié)同效果。miRNA芯片檢測(cè)IFNβ和RBV治療能導(dǎo)致Huh7細(xì)胞138種miRNAs輕微變化。
　　 3.IFNβ聯(lián)合RBV治療對(duì)含有HCV亞復(fù)制子的Huh7細(xì)胞miR-122和其他miRNA的表達(dá)影響:同樣,RBV能以劑量依賴(lài)

9、方式分別抑制細(xì)胞生長(zhǎng),IFNβ能以劑量和時(shí)間依賴(lài)方式誘導(dǎo)細(xì)胞ISG54和miR-196b表達(dá),聯(lián)合治療沒(méi)有協(xié)同效果。IFNβ和RBV均能輕微抑制細(xì)胞miR-122水平,聯(lián)合治療無(wú)明顯協(xié)同效果。關(guān)鍵是,IFNβ和RBV治療能協(xié)同抑制含有HCV亞復(fù)制子的Huh7細(xì)胞HCV RNA水平。同樣,miRNA芯片檢測(cè)IFNβ和RBV治療僅能導(dǎo)致含有HCV亞復(fù)制子的Huh7細(xì)胞16種miRNAs輕微變化,提示生物學(xué)作用有限。
　　 結(jié)論：

10、r>　　 1.應(yīng)用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR方法能夠特異、敏感地檢測(cè)出Huh7細(xì)胞高(miR-122)、中(miR-24)、低(miR-146a)拷貝的miRNAs,而poly(A)加尾逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR方法只能檢測(cè)出高(miR-122)拷貝的miRNA。
　　 2.IFNβ可上調(diào)含和不含HCV亞復(fù)制子的Huh7細(xì)胞ISG54,RBV可抑制細(xì)胞增殖,聯(lián)合用可協(xié)同下調(diào)HCV RNA。然而RBV和IFNβ治療僅引起肝特異性m