T輔助細胞亞群聯(lián)合檢測對系統(tǒng)性紅斑狼瘡病情評估價值的研究.pdf

1、研究背景：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種自身免疫介導(dǎo)的，以免疫性炎癥為主要表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病。臨床主要特征是多個器官、系統(tǒng)受累和血清檢測到多種自身抗體（以抗核抗體為代表）。SLE病程遷延，病死率高，病因至今未明,也無特異有效的治療方法。SLE發(fā)病過程中同時存在細胞免疫和體液免疫系統(tǒng)紊亂兩種形式，而T淋巴細胞的異常并導(dǎo)致B淋巴細胞的過度活化，最終導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的異常應(yīng)答是其主要發(fā)

2、病機制。近年來國內(nèi)外對SLE的免疫紊亂研究趨于深入，多項研究認為由于SLE患者自身淋巴細胞平衡被打破，過度活化的T淋巴細胞導(dǎo)致多克隆B細胞分化和激活，從而產(chǎn)生大量自身抗體引起多系統(tǒng)損害受累。目前認為的T淋巴細胞的異?？赡苁荢LE發(fā)病的重要因素。有研究表明SLE患者Th的凋亡顯著增加，且凋亡水平與疾病活動性相關(guān)，因此，T輔助淋巴細胞（Th）的數(shù)量及功能失衡是T淋巴細胞免疫功能異常的重要方面。Th淋巴細胞不是單一的一種細胞群，而是包含了一系

3、列具有不同職能的細胞亞群，幼稚CD4+T淋巴細胞可以分化為Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)，四種細胞分泌的細胞因子以及在體內(nèi)免疫作用各不相同。因此，這些不同職能的細胞亞群在分化、發(fā)育及功能執(zhí)行等方面存在著錯綜復(fù)雜的關(guān)系，需要對Th細胞亞型在系統(tǒng)性紅斑狼瘡病因機制方面發(fā)揮的作用進行深入細致的研究，才能有助于進一步明確Th細胞在SLE的作用。早期，人們僅僅關(guān)注于Th1/Th2的失衡狀態(tài)與SLE的發(fā)病關(guān)系。認為Th1/Th2

4、的平衡狀態(tài)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中起著決定性的作用，其間，“Th2優(yōu)勢”、“Th1優(yōu)勢”等多種免疫紊亂狀態(tài)均在狼瘡動物模型及患者體內(nèi)被證實。但隨著對SLE研究的深入，發(fā)現(xiàn)很多SLE臨床征象和實驗室特點不能用已知的Th1/Th2失衡模式來解釋。近年來對T輔助細胞亞群的認識更加全面，在原有Th1/Th2細胞亞群基礎(chǔ)上，Sakaguchi和Harrington先后在1995年和2005年又發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）和Th17兩個新成員。逐漸發(fā)現(xiàn)

5、Th17/Treg的平衡狀態(tài)在SLE的疾病過程中發(fā)揮著重要作用。兩者同屬于Th細胞，但分化相互抑制，生物學(xué)表現(xiàn)完全相反。Th17啟動自身免疫疾病發(fā)生, Treg細胞可減輕自身免疫病反應(yīng),兩者相互拮抗相互抑制維持機體免疫狀態(tài)的相對穩(wěn)定。Th1、Th2、Th17、Treg細胞均參與了SLE的致病過程，并且Th1/Th2、Th17/Treg的失衡狀態(tài)可能導(dǎo)致SLE患者細胞功能紊亂，進而引起B(yǎng)細胞異?；罨侔l(fā)和加劇SLE病情變化。研究顯示，T

6、h17/Treg細胞亞群失衡狀態(tài)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中可能更為嚴重，從而在某種程度上，兩組細胞平衡狀態(tài)可以作為SLE疾病活動和病情評價的可靠指標。故將Th1/Th2、Th17/Treg作為一個觀察整體，可能比單純研究某類細胞的變化來推斷SLE疾病狀態(tài)更加科學(xué)系統(tǒng)?？傊?，本研究從Th細胞的凋亡情況入手，深入分析Th1/Th2，Th17/Treg在SLE中的失衡狀態(tài)，并相對全面系統(tǒng)分析Th1/Th2，Th17/Treg相關(guān)細胞因子譜變化特點

7、，并對新成員Th17/Treg的特異轉(zhuǎn)錄因子的平衡狀態(tài)進一步探究，以期通過相對較大樣本的SLE病例資料，聯(lián)合測定Th細胞亞群細胞、蛋白、基因水平變化及相應(yīng)的SLE的疾病活動指標，探討Th細胞亞群與SLE疾病活動性臨床癥狀的關(guān)系及其對病情評估的價值。
　　 目的：（1）通過比較系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和正常對照之間，SLE輕型、中度活動及重型患者之間的Th細胞凋亡情況，分析SLE患者Th細胞的凋亡與SLE疾病活動指數(shù)的關(guān)聯(lián)。（2）通過比

8、較系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和正常對照之間，SLE輕型、中度活動及重型患者之間的Th1/Th2、Th17/Treg細胞平衡情況，分析Th1/Th2、Th17/Treg細胞與SLE的關(guān)系。（3）系統(tǒng)分析SLE患者和正常對照之間，SLE輕型、中度活動及重型患者之間的Th1、Th2、Th17、Treg細胞因子水平，進一步驗證Th1/Th2、Th17/Treg細胞與SLE的關(guān)系。（4）初步研究SLE患者和正常對照之間，SLE輕型、中度活動及重型患者之間

9、的Th17/Treg分化路徑上游特異的轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3水平，進一步驗證Th1/Th2、Th17/Treg細胞與SLE的關(guān)系。深入了解Th17和調(diào)節(jié)性T細胞在SLE發(fā)病及病情進展過程中的意義。
　　 方法：病例選取2009年6月至2010年9月在山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院和中國人民解放軍第264醫(yī)院風(fēng)濕科就診SLE患者89例，診斷均符合1997年修訂的美國風(fēng)濕學(xué)會（American College ofRheumatolo

10、gy,ACR）分類標準。收集SLE患者一般情況和臨床資料，根據(jù)SLE疾病活動指數(shù)（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）積分評估疾病的活動性，并結(jié)合臨床癥狀將患者分為輕型SLE、中度活動型、重型三組。同時選取正常對照組27名，均不符合SLE診斷標準；無其他重大疾病史；未長期應(yīng)用激素或免疫抑制劑；受檢者本人或直系的親屬未患有自身免疫性疾病。實驗在獲得研究對象知

11、情同意后，抽取外周靜脈血。采用流式細胞術(shù)檢測SLE患者和正常對照之間，SLE輕型、中度活動及重型患者之間Th細胞凋亡率和Th1/Th2、Th17/Treg細胞水平。采用流式細胞微球捕獲技術(shù)（CBA）和ELSIA測定SLE患者和正常對照之間，SLE輕型、中度活動及重型患者之間IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ，IL-17A和TGF-β水平采用RT-PCR檢測SLE患者和正常對照之間，SLE輕型、中度活動及重型

12、患者之間血清Th17/Treg特異轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3 mRNA表達水平采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果：（1） 流式細胞術(shù)來測定Th細胞的凋亡情況顯示SLE患者和正常人CD4+T淋巴細胞凋亡率分別為（1.11±0.36）％和（0.36±0.15）％，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.0001）。輕型、中型、重型SLE患者組和正常對照組Th細胞凋亡率分別為（0.81±0.19）％、（1.03±0.2

13、1）％、（1.51±0.31）％和（0.36±0.15）％，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.0001）（2）流式細胞術(shù)測定四種Th細胞情況：SLE患者組Th1顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.049）。SLE患者組Th2與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。重型SLE患者Th1/Th2與中度活動組及輕型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析顯示：Th2/CD4+與SLEDAI呈正相關(guān)（r=0.4012, P=0.0001）,Th1/Th2

14、與SLEDAI呈負相關(guān)（r=-0.2683，P=0.0130）。SLE患者組Th17與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但Th17占CD4+T細胞兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012），患者組比例較正常人高。SLE患者組Treg低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.023)。重型SLE患者Th17、Th17/CD4+、Treg與正常對照組及輕型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析顯示：SLEDAI與Th17、Th17/CD4+和Th17/T

15、reg呈正相關(guān)（r=0.3608,P=0.0006, r=0.4522, P＜0.001,r=0.4240, P＜0.001），與Treg呈負相關(guān)（r=-0.352, P=0.0010）。（3）相關(guān)細胞因子測定結(jié)果：流式細胞微球捕獲技術(shù)（CBA）測定SLE患者組與正常對照組IL-17、IL-10、IL-6、IL-4比較顯著增高（P均<0.05）其余細胞因子比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析顯示：IL-17、IL-6、IL-4與SLEDAI

16、呈正相關(guān)，IL-2、IFN-γ與SLEDAI呈負相關(guān)，尚不能認為TNF、IL-10與SLEDAI有相關(guān)性。IL-17在不同活動度組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，且在SLE重型患者中增高最為明顯（F=52.660，P＜0.001）。IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-4、IL-2在不同活動度組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TNF-α水平在不同活動度組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ELISA測定TGF-β結(jié)果顯示SLE患者和正常對照之

17、間，SLE輕型、中度活動及重型患者之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.150，P=0.157）。相關(guān)性分析顯示：尚不能認為TGF-β水平與SLEDAI有相關(guān)性（r=-0.071，P=0.5150）。（4）RT-PCR實驗結(jié)果顯示SLE患者Th17、Treg細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt、Foxp3的mRNA經(jīng)RT-PCR擴增后均有所表達。SLE組ROR-γt、Foxp3的mRNA表達變化倍率顯著高于正常對照組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t

18、=-2.656，P=0.012；t=-2.873，P=0.007）。不同活動度SLE患者組間ROR-γt mRNA表達組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.335，P=0.047），F(xiàn)oxp3 mRNA組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.119，P=0.129）。相關(guān)性分析顯示：ROR-γt與SLEDAI、Th17呈正相關(guān)（r=0.4969, P=0.0038, r=0.3960, P=0.0992），尚不能認為與其他相關(guān)Th細胞及細胞因子有

19、相關(guān)性, 同時尚不能認為Foxp3與SLEDAI及相關(guān)Th細胞及細胞因子有相關(guān)性。
　　 結(jié)論：SLE患者存在Th細胞凋亡異常情況，且Th細胞凋亡率與SLEDAI 評分有顯著相關(guān)性。Th2/CD4+、Th17、Th17/CD4+、Th17/Treg與SLEDAI呈正相關(guān)，Th1/Th2、Treg與SLEDAI呈負相關(guān)。細胞因子檢測IL-17、IL-6、IL-4與SLEDAI呈正相關(guān)，IL-2、IFN-γ與SLEDAI呈負相關(guān)，T