一個新的Arf6特異性GTP酶激活蛋白ACAP4的發(fā)現(xiàn)與功能研究.pdf

1、ADP核糖基化因子(Arfs)是真核細胞中廣泛表達的且是高度保守的GTP結合蛋白家族，是Ras超家族成員之一。從生化特性和序列的相似性上，Arfs蛋白分為Arf蛋白和Arf相似蛋白。Arf蛋白可再被劃分為三類，第一類包括Arf1，Arf2和Arf3；第二類包括Arf4和Arf5；第三類只有Arf6。與其它的GTP結合蛋白一樣，Arfs蛋白在功能上是一個分子開關，在GTP結合狀態(tài)和GDP結合狀態(tài)之間循環(huán)，它與許多不同的靶蛋白結合影響一系列

2、細胞事件。Arf6是唯一在細胞質(zhì)膜上發(fā)揮功能的Arf蛋白，GTP結合的Arf6調(diào)節(jié)內(nèi)吞膜的運輸，同時調(diào)節(jié)在細胞外周的細胞骨架變化。對Arf6的功能來說，關鍵性因素是GTP結合狀態(tài)的時期，細胞內(nèi)Arf6與GTP結合或與GDP結合是分別由鳥苷交換因子和GTP酶激活蛋白(GAPs)協(xié)調(diào)來實現(xiàn)的。GAPs是Arf功能關鍵性調(diào)節(jié)子，控制Arf回到失活的GDP結合狀態(tài)。據(jù)報道Arf6的周期性變化是調(diào)節(jié)乳腺癌細胞侵襲的必需條件，然而，Arf6介導的細

3、胞遷移的分子機制了解依然很少。 為了系統(tǒng)地分析在細胞遷移過程中，參與調(diào)節(jié)Arf6活性的蛋白，利用功能蛋白質(zhì)組學的方法，通過質(zhì)譜鑒定篩選特異地與激活態(tài)的Arf6結合的蛋白。我們鑒定了一個Arf蛋白新的GTP酶激活蛋白，根據(jù)它包含的保守的結構特征，命名為ACAP4。和以前描述的Arf激活蛋白ASAP1，PAP/PAG3及ACAP1/2一樣，ACAP4被劃入AZAP蛋白家族，它們擁有許多共同的結構基序，包括兩個coiled-coil結

4、構，一個PH結構，一個GAP結構以及兩個ANK重復結構。 我們生化結果證明ACAP4有磷酸肌醇依賴的GAP活性，ACAP4是一個Arf6特異的GTP酶激活蛋白。體外活性檢測結果顯示Arf6是ACAP4的偏好底物，而不是Arf1和Arf5蛋白。在HeLa細胞中，過表達ACAP4能抑制AlF4誘導的Arf6依賴的膜突起的形成。另外，ACAP4被募集到細胞外周，管狀的膜結構上，Arf6的激活引起內(nèi)吞膜重新回到細胞質(zhì)膜。在非EGF的刺激

5、下，ACAP4的過表達抑制Arf6被募集到膜皺褶處，但是在EGF的刺激下，ACAP4與Arf6共定位于actin豐富的膜皺褶上。ACAP4和actin聚合相關蛋白N-WASP相互作用，它們也共定位于膜皺褶上，暗示ACAP4可能以不依賴GAP活性的方式調(diào)節(jié)actin細胞骨架。表達GTP水解缺失的突變體Arf6Q67L導致ACAP4和Arf6在胞漿內(nèi)PIP2豐富的膜上積聚，暗示GTP的水解是Arf6依賴的膜-細胞骨架的重排所必需的。值得注意

6、地是，在傷口復原實驗中，通過對RNA干擾技術使細胞內(nèi)ACAP4的表達下調(diào)或是轉染Arf6的GTP水解GAP活性缺失突變體過表達能抑制Arf6依賴的細胞遷移，證明ACAP4在細胞遷移中有非常重要的作用，我們的研究也為研究Arf6介導的細胞遷移揭示了新的方向。此外，我們的初步研究揭示Arf6與ACAP4在一些高遷移潛能腫瘤細胞株中的高表達，進一步功能鑒定正在進行中。 綜上所述，ACAP4是一個新的Arf6特異性GTP酶激活蛋白，調(diào)節(jié)