UPT十通道免疫層析試紙盤(pán)檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)的建立及其在鼠疫菌抗體譜篩查中的應(yīng)用.pdf

1、一．以新型光學(xué)材料上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒(Up-Converting Phospher,UCP)為標(biāo)記物，制備雙抗原夾心模式的上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析(Up-converting PhosphlorTechnology based Later-Flow assay,UPT-LF assay）單靶標(biāo)抗體檢測(cè)試紙，在此基礎(chǔ)上建立一種UPT-LF十通道試紙盤(pán)檢測(cè)系統(tǒng)。
　　 二．將UPT十通道試紙盤(pán)檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)用于鼠疫菌感染動(dòng)物及鼠疫患者血清標(biāo)本中的

2、十種抗原相應(yīng)抗體譜的篩查分析，尋找除F1抗原外與鼠疫菌診斷相關(guān)的補(bǔ)充型特異性抗原。
　　 方法：
　　 首先在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中克隆、表達(dá)十種鼠疫茵蛋白，經(jīng)镲柱親和層析純化，包涵體形式的表達(dá)蛋白經(jīng)尿素梯度透析復(fù)性，獲得有活性的重組蛋白，以各重組蛋白為抗原分別常規(guī)免疫新西蘭大白兔，從免疫兔血清中提取抗體，經(jīng)正辛酸—硫酸銨法純化獲得各蛋白相應(yīng)的多克隆抗體IgG。
　　 再以配對(duì)的抗原抗體為生物材料研制UPT-LF單靶

3、標(biāo)抗體檢測(cè)試紙，用UCP標(biāo)記抗原，以雙抗原夾心模式檢測(cè)其對(duì)應(yīng)抗體，逐一制備分別檢測(cè)10種不同抗體靶標(biāo)的UPT-LF試紙，以含有各種純化鼠疫菌抗體IgG的兔血清為模擬樣品，通過(guò)對(duì)模擬樣品的檢測(cè)評(píng)價(jià)各試紙的檢測(cè)性能，包括定量檢測(cè)能力、靈敏度、精密性和穩(wěn)定性四個(gè)方面。
　　 將十種試紙通過(guò)條件優(yōu)化以及兼容性調(diào)整后整合入U(xiǎn)PT-LF十通道試紙盤(pán)，使待測(cè)樣品在分條的情況下進(jìn)行同步均勻的多重層析，利用UPT十通道生物傳感器獲取試紙盤(pán)對(duì)樣品的

4、檢測(cè)數(shù)據(jù)，最終實(shí)現(xiàn)一個(gè)樣品中十種重要蛋白相關(guān)抗體譜的同步檢測(cè)。通過(guò)對(duì)相同模擬樣品的分條檢測(cè)和整盤(pán)檢測(cè)的比較，評(píng)價(jià)UPT十通道試紙盤(pán)檢測(cè)結(jié)果與試紙檢測(cè)結(jié)果的一致性。
　　 最后利用此多重檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)118份鼠疫菌感染（間接血凝抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)F1抗體陽(yáng)性為選擇標(biāo)準(zhǔn)）的實(shí)際血清（13份猴血清，54份兔血清，51份患者血清）樣品中的10種鼠疫菌抗體進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)對(duì)所有血清樣品做了ELISA方法檢測(cè)，并對(duì)UPT和ELISA兩種方法的定性檢測(cè)

5、結(jié)果進(jìn)行了比較分析，還對(duì)猴血清中兩種檢測(cè)方法定性結(jié)果出現(xiàn)差異的標(biāo)本做了Western Blot驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：
　　 一．在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)了8種鼠疫菌蛋白，其中YopD和YPO1613為上清形式表達(dá)，其余的YPO1089，YPO1303，YPO1435，YPO2131，YPO2118，YPO3827為包涵體形式表達(dá)。
　　 二．利用表達(dá)的8種蛋白及實(shí)驗(yàn)室已有的F1和LcrV蛋白免疫動(dòng)物，獲得了10

6、種蛋白對(duì)應(yīng)的多克隆抗體IgG。其ELISA效價(jià)和濃度(mg/ml)分別為：YPO3827抗體(1:51，200，9)，YP02131抗體(1:204，800，20)，LcrV抗體(1:204，800，40)，YPO1089抗體(1:109.600，12)，YP01303抗體(1:25，600，22)，YopD抗體(1:51，200，25)，YPO1435抗體(1:204，800，29)，YPO1613抗體(1:204,800，17)，F(xiàn)

7、I抗體(1:204，800，12)，YPO2118抗體（1:51.200，17）。
　　 三．利用10種配對(duì)的鼠疫菌抗原抗體制備了10種雙抗原夾心模式檢測(cè)抗體的UPT-LF試紙。對(duì)模擬樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，10種試紙均有良好的線性定量檢測(cè)能力，線性擬合決定系數(shù)R2在0.93-0.99之間。有5種條的檢測(cè)靈敏度(F1，YP01435，LcrV，YP01089，YP02131)與ELISA靈敏度持平，其余5種梢低于ELISA。各試紙精

8、密性檢測(cè)中變異系數(shù)(CV)分別在6.4％-15.2%之間，37℃的穩(wěn)定存放期在10天-21天之間。
　　 四．成功制備了能同時(shí)快速檢測(cè)十種生物靶標(biāo)的UPT-LF十通道檢測(cè)系統(tǒng)，包括UPT-LF十通道試紙盤(pán)和UPT十通道生物傳感器，對(duì)模擬樣品中10種抗體靶標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果顯示，整盤(pán)檢測(cè)和分條檢測(cè)的結(jié)果有良好的一致性，包括樣品檢測(cè)值和重復(fù)檢測(cè)變異系數(shù)都基本一致。故試紙盤(pán)檢測(cè)的線性定量能力、靈敏度及精密性和穩(wěn)定性都可沿用單抗體靶標(biāo)試紙的檢

9、測(cè)性能評(píng)價(jià)結(jié)果。
　　 五．對(duì)118份實(shí)際血清（13份猴血清、54份兔血清、51份患者血清）樣品同時(shí)用UPT-LF十通道系統(tǒng)與ELISA兩種方法進(jìn)行10種靶標(biāo)抗體的抗體譜檢測(cè)分析，檢測(cè)結(jié)果隨樣品種屬不同呈現(xiàn)一定的差異：
　　 ◆猴血清：13份猴血清標(biāo)本的130個(gè)檢測(cè)中有112個(gè)檢測(cè)定性結(jié)果相同，18個(gè)定性結(jié)果不同，總體無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。WB驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示18個(gè)有差異的檢測(cè)結(jié)果中11份為UPT結(jié)果正確，7個(gè)為ELISA結(jié)果正確。

10、10種靶標(biāo)抗體中陽(yáng)性率超過(guò)500%的有6種，按由高到低排列依次為，F(xiàn)1(100%)、YopD(100%)、LcrV(92%)、YP9O1303(64%0)、YPO2118(55%)、YPO3827(50%)：
　　 ◆兔血清：54份兔血清標(biāo)本的540個(gè)檢測(cè)中有349個(gè)定性結(jié)果相同，191個(gè)不同，以兩種方法定性結(jié)果一致的標(biāo)本數(shù)計(jì)算抗體陽(yáng)性率，超過(guò)50%的有3個(gè)，依次為F1(100%)、YP01089(75%)、YopD(71.9%

11、)
　　 ◆患者血清：51份患者血清標(biāo)本的510個(gè)檢測(cè)中有391個(gè)定性結(jié)果相同，119個(gè)不同，以兩種方法定性結(jié)果一致的標(biāo)本數(shù)計(jì)算抗體陽(yáng)性率，超過(guò)50%的有4個(gè)，依次為F1(100%)、YopD(83%)、YP01435(61%)、LcrV(54%)。
　　 結(jié)論：
　　 一．本研究首次建立了一種UPT免疫層析十通道檢測(cè)系統(tǒng)，它不僅可檢測(cè)抗體，也可被用于檢測(cè)抗原。隨著UPT-LF試紙開(kāi)發(fā)種類的增多，此系統(tǒng)還可能被廣