UPT十通道免疫層析試紙盤檢測技術平臺的建立及其在鼠疫菌抗體譜篩查中的應用.pdf

1、一．以新型光學材料上轉換發(fā)光顆粒(Up-Converting Phospher,UCP)為標記物，制備雙抗原夾心模式的上轉換發(fā)光免疫層析(Up-converting PhosphlorTechnology based Later-Flow assay,UPT-LF assay）單靶標抗體檢測試紙，在此基礎上建立一種UPT-LF十通道試紙盤檢測系統(tǒng)。
　　 二．將UPT十通道試紙盤檢測系統(tǒng)應用于鼠疫菌感染動物及鼠疫患者血清標本中的

2、十種抗原相應抗體譜的篩查分析，尋找除F1抗原外與鼠疫菌診斷相關的補充型特異性抗原。
　　 方法：
　　 首先在大腸桿菌表達系統(tǒng)中克隆、表達十種鼠疫茵蛋白，經镲柱親和層析純化，包涵體形式的表達蛋白經尿素梯度透析復性，獲得有活性的重組蛋白，以各重組蛋白為抗原分別常規(guī)免疫新西蘭大白兔，從免疫兔血清中提取抗體，經正辛酸—硫酸銨法純化獲得各蛋白相應的多克隆抗體IgG。
　　 再以配對的抗原抗體為生物材料研制UPT-LF單靶

3、標抗體檢測試紙，用UCP標記抗原，以雙抗原夾心模式檢測其對應抗體，逐一制備分別檢測10種不同抗體靶標的UPT-LF試紙，以含有各種純化鼠疫菌抗體IgG的兔血清為模擬樣品，通過對模擬樣品的檢測評價各試紙的檢測性能，包括定量檢測能力、靈敏度、精密性和穩(wěn)定性四個方面。
　　 將十種試紙通過條件優(yōu)化以及兼容性調整后整合入UPT-LF十通道試紙盤，使待測樣品在分條的情況下進行同步均勻的多重層析，利用UPT十通道生物傳感器獲取試紙盤對樣品的

4、檢測數(shù)據(jù)，最終實現(xiàn)一個樣品中十種重要蛋白相關抗體譜的同步檢測。通過對相同模擬樣品的分條檢測和整盤檢測的比較，評價UPT十通道試紙盤檢測結果與試紙檢測結果的一致性。
　　 最后利用此多重檢測系統(tǒng)對118份鼠疫菌感染（間接血凝抑制實驗檢測F1抗體陽性為選擇標準）的實際血清（13份猴血清，54份兔血清，51份患者血清）樣品中的10種鼠疫菌抗體進行了檢測，同時對所有血清樣品做了ELISA方法檢測，并對UPT和ELISA兩種方法的定性檢測

5、結果進行了比較分析，還對猴血清中兩種檢測方法定性結果出現(xiàn)差異的標本做了Western Blot驗證。
　　 結果：
　　 一．在大腸桿菌表達系統(tǒng)中成功表達了8種鼠疫菌蛋白，其中YopD和YPO1613為上清形式表達，其余的YPO1089，YPO1303，YPO1435，YPO2131，YPO2118，YPO3827為包涵體形式表達。
　　 二．利用表達的8種蛋白及實驗室已有的F1和LcrV蛋白免疫動物，獲得了10

6、種蛋白對應的多克隆抗體IgG。其ELISA效價和濃度(mg/ml)分別為：YPO3827抗體(1:51，200，9)，YP02131抗體(1:204，800，20)，LcrV抗體(1:204，800，40)，YPO1089抗體(1:109.600，12)，YP01303抗體(1:25，600，22)，YopD抗體(1:51，200，25)，YPO1435抗體(1:204，800，29)，YPO1613抗體(1:204,800，17)，F(xiàn)

7、I抗體(1:204，800，12)，YPO2118抗體（1:51.200，17）。
　　 三．利用10種配對的鼠疫菌抗原抗體制備了10種雙抗原夾心模式檢測抗體的UPT-LF試紙。對模擬樣品的檢測結果顯示，10種試紙均有良好的線性定量檢測能力，線性擬合決定系數(shù)R2在0.93-0.99之間。有5種條的檢測靈敏度(F1，YP01435，LcrV，YP01089，YP02131)與ELISA靈敏度持平，其余5種梢低于ELISA。各試紙精

8、密性檢測中變異系數(shù)(CV)分別在6.4％-15.2%之間，37℃的穩(wěn)定存放期在10天-21天之間。
　　 四．成功制備了能同時快速檢測十種生物靶標的UPT-LF十通道檢測系統(tǒng)，包括UPT-LF十通道試紙盤和UPT十通道生物傳感器，對模擬樣品中10種抗體靶標的檢測結果顯示，整盤檢測和分條檢測的結果有良好的一致性，包括樣品檢測值和重復檢測變異系數(shù)都基本一致。故試紙盤檢測的線性定量能力、靈敏度及精密性和穩(wěn)定性都可沿用單抗體靶標試紙的檢

9、測性能評價結果。
　　 五．對118份實際血清（13份猴血清、54份兔血清、51份患者血清）樣品同時用UPT-LF十通道系統(tǒng)與ELISA兩種方法進行10種靶標抗體的抗體譜檢測分析，檢測結果隨樣品種屬不同呈現(xiàn)一定的差異：
　　 ◆猴血清：13份猴血清標本的130個檢測中有112個檢測定性結果相同，18個定性結果不同，總體無統(tǒng)計學差異。WB驗證實驗顯示18個有差異的檢測結果中11份為UPT結果正確，7個為ELISA結果正確。

10、10種靶標抗體中陽性率超過500%的有6種，按由高到低排列依次為，F(xiàn)1(100%)、YopD(100%)、LcrV(92%)、YP9O1303(64%0)、YPO2118(55%)、YPO3827(50%)：
　　 ◆兔血清：54份兔血清標本的540個檢測中有349個定性結果相同，191個不同，以兩種方法定性結果一致的標本數(shù)計算抗體陽性率，超過50%的有3個，依次為F1(100%)、YP01089(75%)、YopD(71.9%

11、)
　　 ◆患者血清：51份患者血清標本的510個檢測中有391個定性結果相同，119個不同，以兩種方法定性結果一致的標本數(shù)計算抗體陽性率，超過50%的有4個，依次為F1(100%)、YopD(83%)、YP01435(61%)、LcrV(54%)。
　　 結論：
　　 一．本研究首次建立了一種UPT免疫層析十通道檢測系統(tǒng)，它不僅可檢測抗體，也可被用于檢測抗原。隨著UPT-LF試紙開發(fā)種類的增多，此系統(tǒng)還可能被廣