室溫穩(wěn)定PCR試劑及其在鼠疫菌檢測(cè)中的應(yīng)用的研究.pdf

1、鼠疫是人類歷史上最古老、最嚴(yán)重的烈性傳染病之一，由于鼠疫的爆發(fā)流行往往給人類造成重大傷亡，所以對(duì)鼠疫耶爾森氏菌（以下簡(jiǎn)稱鼠疫菌）的檢測(cè)和防治一直被鼠疫學(xué)界和醫(yī)學(xué)界所重視。對(duì)于鼠疫菌的檢測(cè)方法主要有，傳統(tǒng)的“四步檢驗(yàn)法”、基于血清學(xué)和核酸的各種方法；以Taqman探針為基礎(chǔ)的熒光定量PCR方法屬于基于核酸的檢測(cè)方法之一.
　　 目的：盡管基于Taqman探針的熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)被用于檢測(cè)和鑒定鼠疫菌多年，關(guān)于定量PCR試劑在室

2、溫條件下的穩(wěn)定性研究卻少見于報(bào)道，而在實(shí)際應(yīng)用中無論是鼠疫流病調(diào)查、突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急和反生物恐怖等，室溫條件下穩(wěn)定的PCR檢測(cè)試劑都是必不可少的。本研究中根據(jù)上述現(xiàn)實(shí)需求，先建立用于鼠疫菌檢測(cè)的熒光定量PCR體系，并在此基礎(chǔ)之上摸索出使試劑在室溫保持穩(wěn)定的方法，為實(shí)際應(yīng)用中的需求和將來熒光定量PCR試劑的產(chǎn)品化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：分別根據(jù)鼠疫菌染色體上的3a片段和質(zhì)粒pMTI上編碼F1蛋白的基因cafl設(shè)計(jì)引物和探針

3、序列，建立熒光定量PCR的反應(yīng)體系，優(yōu)化了引物和探針的濃度、反應(yīng)體系中鎂離子的濃度以及反應(yīng)的程序的各參數(shù)。
　　 在驗(yàn)證反應(yīng)體系的特異性實(shí)驗(yàn)里，我們選取的基因組核酸包括：耶爾森氏菌屬的9個(gè)種、鼠疫菌的4中生物型（古典型、中世紀(jì)型、東方型和田鼠型）、與鼠疫菌非常近緣的假結(jié)核耶爾森氏菌16種血清型，以及常見的土拉弗朗西斯氏菌、炭疽芽孢桿菌、布魯氏菌和大腸桿菌DH5α，另外還包括人血液核酸和小鼠基因組。靈敏度實(shí)驗(yàn)中，以鼠疫菌的疫苗株E

4、V76的系列稀釋菌液作為檢測(cè)的樣本，以涂板計(jì)數(shù)法確定菌液濃度。
　　 試劑的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究，參考國內(nèi)外的相關(guān)研究和我實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)積累，我們將反應(yīng)體系混合后加入糖類物質(zhì)作為穩(wěn)定劑；又因?yàn)槊负鸵镌诟稍锏臈l件下保持更久的性質(zhì)，我們將混合好試劑按一個(gè)反應(yīng)體系的劑量分裝到各個(gè)小管中，然后對(duì)試劑真空抽干；在評(píng)估經(jīng)過上述處理的試劑的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，我們將抽干試劑避光分別保存于-20℃和37℃，通過高溫加速對(duì)試劑的破壞作用，取合適時(shí)間點(diǎn)對(duì)兩種條

5、件下保存的試劑使用同一濃度的模板反應(yīng)，檢驗(yàn)試劑在高溫的條件下保持穩(wěn)定的情況。
　　 模擬污染土壤樣本實(shí)驗(yàn)，我們用EV76菌液污染土壤制備模擬的土壤樣本，摸索了一套從土壤樣本中提取核酸、并可成功進(jìn)行熒光定量PCR的處理流程；還進(jìn)行了特異性實(shí)驗(yàn)、靈敏度實(shí)驗(yàn)和盲測(cè)實(shí)驗(yàn)。
　　 最后我們將自制的產(chǎn)品化試劑與國外同類的鼠疫菌檢測(cè)試劑進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證在現(xiàn)場(chǎng)的條件下對(duì)于水體樣本和純菌液樣本的檢測(cè)效果，為將來使用自制試劑替代進(jìn)口試劑

6、提供了參考。
　　 結(jié)果：優(yōu)化了熒光定量PCR檢測(cè)體系內(nèi)相關(guān)試劑的濃度和反應(yīng)的程序參數(shù)，在驗(yàn)證反應(yīng)體系的特異性實(shí)驗(yàn)里，我們?cè)O(shè)計(jì)的引物和探針只對(duì)鼠疫菌的四種生物型有陽性結(jié)果，而相關(guān)的近緣菌株和非近緣但是常見的菌株都無陽性反應(yīng)，顯示了引物和探針較好的特異性。體系的靈敏度實(shí)驗(yàn)中，3a的引物和探針對(duì)活菌稀釋液的檢測(cè)靈敏度為1.5 CFU每反應(yīng)體系，而caf1的引物和探針的靈敏度為15CFU每反應(yīng)體系。
　　 試劑的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

7、：試劑加入穩(wěn)定劑并抽干后，在37℃、避光保存的條件下，在至少49天的時(shí)間內(nèi)對(duì)低濃度的模板（101拷貝/μl）依然可保證檢測(cè)靈敏度，而對(duì)高濃度的模板（大于102拷貝μl）在79天里依然保證靈敏度。進(jìn)一步的工作中，我們應(yīng)用上述試劑對(duì)使用鼠疫菌疫苗株EV76污染的模擬土壤樣本進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，3a和caf1引物和探針仍然保持了很好的特異性，可檢測(cè)的靈敏度均為5×104 CFU/克土壤；同時(shí)我們也摸索了一套簡(jiǎn)捷、有效的樣本處理方法。
　　 結(jié)

8、論：PCR反應(yīng)體系在室溫條件下的穩(wěn)定性研究在1995年出現(xiàn)，可是隨后相關(guān)方面的研究工作卻很少，而對(duì)于熒光定量PCR檢測(cè)體系而言，尚未見到國內(nèi)外相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，開展這方面的研究無論是對(duì)于普通PCR和熒光定量PCR在現(xiàn)場(chǎng)條件下的應(yīng)用和日常的試劑運(yùn)輸?shù)确矫妫€是為將來我們的試劑可以本土化以取代昂貴的進(jìn)口試劑方面都具有現(xiàn)實(shí)意義。實(shí)驗(yàn)中，真空抽干后的熒光定量PCR檢測(cè)試劑在37℃至少可保存49天而保持其檢測(cè)準(zhǔn)確性和重復(fù)性，提示在實(shí)際應(yīng)用中試劑可以