基于可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分型方法的結(jié)核分子流行病學研究.pdf

1、目的：初步探討15個可變數(shù)目串聯(lián)重復(Variable Number Tandem Repeat，VNTR)位點在天津地區(qū)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)中的多態(tài)性、天津地區(qū)的主要流行菌株以及VNTR分型方法在結(jié)核分子流行病學中的主要應(yīng)用。 方法：選取天津市結(jié)核病控制中心參比實驗室菌種庫中2005年6月至2006年4月的100株MTB，收集這100例確診肺結(jié)核患者的一般資料和實驗室資料

2、。將菌株復蘇傳代，提取其基因組DNA。采用PCR方法擴增結(jié)核菌基因組中的15個VNTR位點，包括由12個結(jié)核分枝桿菌散在重復單元(Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit，MIRU)和5個精確串聯(lián)重復序列(Exact Tandem Repeats，ETR)(其中的兩個與MIRU位點一致)。擴增的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，應(yīng)用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR產(chǎn)物并通過Quantity One4

3、.4分析軟件確定PCR產(chǎn)物的片段長度并與標準菌株H<,37>Rv比較計算得到每個菌株不同串聯(lián)重復位點的拷貝數(shù)，將部分菌株的VNTR位點PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測序；評價每個VNTR位點的多態(tài)性以及MIRU位點和ETR位點對天津地區(qū)結(jié)核菌株的綜合分辨能力。應(yīng)用PAUP4.0軟件繪制系統(tǒng)樹圖，揭示菌株之間的相互關(guān)系。根據(jù)VNTR基因分型結(jié)果，設(shè)計調(diào)查表，收集成簇菌株的患者資料，用以追蹤同一簇患者問的相互傳播途徑。應(yīng)用SPSS11.5進行卡

4、方檢驗和單因素Logistic回歸分析。 結(jié)果： 1、基本資料描述：本次研究中的100株MTB分別來自100名肺結(jié)核患者，患者的男女比例為1.9：1，年齡的中位數(shù)為36歲(15-82歲)，以20-29歲患者比例最高。市內(nèi)六區(qū)患者占患者總數(shù)的81％，初治患者占81％，有卡介苗接種史的患者占68％。 2、本次研究中58株MTB的5個ETR-VNTR位點拷貝數(shù)編碼均為42435，另有兩株編碼分別為42436和42433

5、，均屬于具有北京家族VNTR分型特點的菌株，共占實驗菌株總數(shù)的60％。 3、5個ETR-VNTR位點僅將菌株分為23個基因型，獨立株17株，6個簇，最大簇包含58株菌；12個MIRU-VNTR位點將菌株分為45個基因型，獨立株36株，9個簇，最大簇包含34株菌；MIRU和ETR-VNTR相結(jié)合后將菌株可被分為52個基因型，獨立株4l株，11個簇，最大簇包含29株菌。成簇組與非成簇組患者在性別，年齡，住址，治療史，卡介苗接種史等方

6、面的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 4、VNTR位點等位基因多樣性(h)分析結(jié)果顯示：MIRU-26和MIRU-31位點多態(tài)性較好h分別為0.54和0.45；其次為MIRU-10，40和ETR-A，0.3

7、比較結(jié)果顯示：單獨使用5個ETR位點、12個MIRU位點和兩者結(jié)合后分辨能力HGDI分別為0.6503，0.8622和0.9093。 5、PAUP分析表明，100株MTB可被分為三組(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ)，其中89株菌屬于第Ⅲ組，屬于Ⅰ，Ⅱ兩組的菌株分別為6株和5株。 6、對成簇組的結(jié)核病患者資料進一步調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其中2名患者為相繼發(fā)病的某中學同班同學，可以確定這兩名患者處于同一條傳播鏈上。 結(jié)論：15個VNTR位點中MI