DERA酶的原核表達(dá)及阿托伐他汀鈣手性中間體的生物合成.pdf

1、阿托伐他汀鈣是可以同時(shí)降低總膽固醇和甘油三酯的藥物，屬3-羥基-3-甲基-戊二酰-輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑。目前阿托伐他汀鈣手性中間體的合成方法有兩種，一種是化學(xué)合成法即外消旋混合物的手性拆分，另一種是生物催化法。但是，化學(xué)合成法需要使用危險(xiǎn)性或高毒性物質(zhì)和昂貴化合物，而且合成步驟繁瑣、原料利用率低、產(chǎn)物中雜質(zhì)較多、污染物排放嚴(yán)重。目前，生物合成法越來越被重視，其中用的最多的方法是2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶（Deox

2、yribosePhosphateAldolase，DERA）催化。
　　枯草芽孢桿菌UD-20(Bacillussubtilis.UD-20)為本實(shí)驗(yàn)室分離的植物內(nèi)生菌，具有DERA酶活性。本研究利用PCR技術(shù)從該菌基因組DNA中擴(kuò)增得到DERA酶基因核苷酸序列。該核苷酸序列的大小為672bp，編碼的蛋白含有223個(gè)氨基酸、pI（等電點(diǎn)）為5.04、理論分子量約為23.23KDa。用在線分析軟件ClustalW對(duì)該氨基酸與GenB

3、ank中已登錄的其它來源的DERA酶氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果顯示該氨基酸與Bacillussubtilissubsp,subtilisstr.SC-8(WP_003227127.1)、Bacillussubtilissubsp.spizizeniistr.W23(YP_003868275.1)和Bacillussubtilissubsp,subtilisstr.168(CAA57662.1)的相似性均達(dá)到98％以上。將Bacillu

4、ssubtilis.UD-20DERA氨基酸序列和模板編號(hào)(PDB:3ngj.1.A)一并提交到SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模。通過對(duì)該模型的觀察發(fā)現(xiàn)該酶涉及到的活性位點(diǎn)Cys47，Asp89，Lys152和Lys181在其它來源的DERA酶中完全保守，具有經(jīng)典的TIM(α/β)8桶結(jié)構(gòu)，屬于TIM-phosphate-binding超家族中的Deoc家族，其中形成Schiff堿的活性Lys殘基在β6側(cè)鏈上，磷酸結(jié)合位點(diǎn)位于β7的末

5、端。
　　將克隆到的DERA基因用BamHⅠ和HindⅢ內(nèi)切酶消化并與同被BamHⅠ和HindⅢ酶消化的表達(dá)載體pET32a連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-DERA，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌Rosetta中，經(jīng)過誘導(dǎo)物(IPTG)誘導(dǎo)獲得了DERA酶的高效表達(dá)。對(duì)重組DERA酶酶活力進(jìn)行初步檢測(cè)，結(jié)果顯示，酶活力可達(dá)0.32U/g（濕菌體，以下均同）。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，蛋白圖譜顯示pET32a表達(dá)系

6、有1條大約為43.4KDa的特異性條帶。
　　本研究從溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間三個(gè)因素對(duì)重組DERA酶基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響進(jìn)行試驗(yàn)，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明該菌發(fā)酵的優(yōu)化組合為:發(fā)酵溫度為26℃、IPTG濃度為0.1mM，誘導(dǎo)時(shí)間為10h，在此條件下發(fā)酵，酶活力可達(dá)2.4U/g，是初始酶活的7.5倍。經(jīng)過響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及回歸方程分析，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響不顯著，最終得出最佳的誘導(dǎo)溫

7、度為26.5℃，最適的IPTG濃度為0.11mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為10h。在此發(fā)酵條件下，酶活力可達(dá)2.6U/g，是初始酶活的8.2倍。響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果與回歸方程分析得出的理論值高度擬合。
　　酶學(xué)性質(zhì)研究表明，DERA酶最適反應(yīng)溫度和pH值分別為40℃和8.0;該酶在35-45℃范圍內(nèi)酶活力比較穩(wěn)定，在50℃保溫30min后，DERA的酶活仍可以保留25.71％，但是在65℃-70℃保溫30min后基本沒有酶活;在pH8.0條

8、件下DERA的酶活力最穩(wěn)定，pH6.0-10.0范圍內(nèi)25℃保溫15min后酶活均能保留46.86％以上，pH7.0-9.0范圍內(nèi)保溫15min酶活均保留53.13％以上，表明該酶在pH7.0-9.0環(huán)境下穩(wěn)定性較好。Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Ba2+具有促進(jìn)DERA酶活的作用，其中Ca2+的激活作用最強(qiáng)，該酶活力提高約29.8％;Mn2+、Co2+和EDTA對(duì)該酶有抑制作用，相對(duì)酶活力為89.1％、68.6％和87.2％;經(jīng)過