心肌細胞阻抗和電位傳感器在離子通道類海洋毒素檢測中的應(yīng)用研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代化工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，海洋生物毒素已經(jīng)嚴重威脅到全人類的生命健康，尤其是離子通道類海洋毒素。它們占了總毒素的80％以上，是海洋生物毒素中分布最廣危害最大的一類毒素，很可能會引發(fā)某些離子通道類疾病。傳統(tǒng)的小鼠生物法為標準的毒素檢測法，但因其種種局限（例如靈敏度低、重復(fù)性差等），已難以滿足海洋毒素日常監(jiān)測的需要。常規(guī)的基于化學(xué)結(jié)構(gòu)的高效液相色譜分析法(HPLC)，因其設(shè)備昂貴和技術(shù)復(fù)雜也難以完全取代小鼠生物法。近年來，一些基于功能活性

2、的細胞檢測法陸續(xù)發(fā)展起來，但傳統(tǒng)的細胞檢測手段較耗時且不能實時反映細胞的動態(tài)信息。
　　細胞傳感器作為一種新型的功能性細胞檢測法，因其無損、高靈敏、實時動態(tài)檢測等優(yōu)勢而備受國內(nèi)外研究者的關(guān)注。目前，細胞傳感器在海洋毒素研究中的應(yīng)用還為數(shù)不多，它結(jié)合了細胞檢測和生物傳感器的各自優(yōu)點，是一項十分有前景的毒素檢測技術(shù)。本文選擇穩(wěn)態(tài)性和魯棒性強的電興奮心肌細胞作為敏感元件，旨在構(gòu)建高性能心肌細胞阻抗和電位傳感器，并將其應(yīng)用于離子通道類海洋

3、毒素的檢測分析。
　　本論文的主要創(chuàng)新性的工作在于:
　　1.設(shè)計了高通量和多通道細胞電位傳感器系統(tǒng)，實現(xiàn)了心肌細胞胞外場電位的高通量和多通道檢測
　　本文設(shè)計了兩種細胞電位傳感器芯片:單孔32通道微電極陣列(MEA)芯片和高通量16孔64通道MEA芯片。同時針對這兩種MEA芯片開發(fā)了3種細胞電位傳感器系統(tǒng):單孔32通道細胞電位傳感器、單孔8通道無線細胞電位傳感器、高通量細胞電位傳感器。最后通過心肌細胞胞外場電位實驗，

4、驗證了三者均具備良好的胞外場電位檢測功能。兩種單孔多通道細胞電位傳感器實現(xiàn)了細胞網(wǎng)絡(luò)胞外場電位(EFP)的多位點檢測。相比于單孔32通道細胞電位傳感器，8通道無線細胞電位傳感器在外型上實現(xiàn)了便攜式小型化，更方便于EFP檢測。高通量細胞電位傳感器在單孔細胞電位傳感器的基礎(chǔ)上實現(xiàn)了多個細胞樣本EFP的同步檢測，大大提高了檢測效率。
　　2.深入研究了促進心肌細胞與傳感器芯片耦合的改進方法，并成功構(gòu)建了高度穩(wěn)定性和一致性的心肌細胞阻抗和

5、電位傳感器
　　本文深入研究了芯片表面蛋白修飾法和優(yōu)化細胞培養(yǎng)密度法對心肌細胞和傳感器芯片耦合的促進作用。研究結(jié)果表明，對于細胞阻抗傳感器(ECIS)芯片而言，心肌細胞按優(yōu)化密度12 k/well（8.5萬/cm2）培養(yǎng)在經(jīng)高分子蛋白明膠修飾的96孔ECIS培養(yǎng)板上，可促使心肌細胞和ECIS芯片形成高度緊密的耦合。在此條件下構(gòu)建的高通量心肌細胞阻抗傳感器，能穩(wěn)定輸出一致性良好的搏動信號（搏動幅值:0.045-0.05;搏動頻率:9

6、0-105次/min），信號穩(wěn)定期（毒素干預(yù)的最佳時期）可以維持32 h;對于MEA芯片而言，研究結(jié)果表明了心肌細胞按優(yōu)化密度12萬/cm2培養(yǎng)在經(jīng)明膠修飾的單孔MEA芯片上，可促使心肌細胞和MEA芯片形成高度緊密的耦合。在此條件下構(gòu)建的單孔8通道無線心肌細胞電位傳感器，能穩(wěn)定輸出一致性良好的胞外場電位(EFP)信號（峰電位幅值:16-1.8 mv;發(fā)放頻率:150-180次/min），信號穩(wěn)定期可以維持60 h。本文同時選了兩種典型的

7、工具藥物異丙腎上腺素和利多卡因?qū)?yōu)化后的兩種高性能心肌細胞傳感器進行了分析性能的測試，實驗結(jié)果表明了心肌細胞阻抗和電位傳感器均對測試藥物做出了正確而靈敏的響應(yīng)，具備良好的檢測分析功能。
　　3.提出了高通量檢測石房蛤毒素(STX)、河豚毒素(TTX)的心肌細胞阻抗傳感器檢測方法
　　本文將優(yōu)化后的高通量心肌細胞阻抗傳感器應(yīng)用于離子通道類海洋毒素的毒性評價，提出了一種新型高通量的離子通道類海洋毒素功能性檢測法。我們主要研究了3

8、種具有代表性的離子通道類海洋毒素(STX、TTX、PbTx-2)的毒性作用。通過分析毒素作用24 h后心肌細胞阻抗傳感器的信號特征參數(shù)（細胞指數(shù)CI、搏動幅值BA、搏動頻率BR）的變化，得出該阻抗傳感器對PbTx-2的敏感性較差，對高濃度（4μM，3.6 ppm）的PbTx-2沒有響應(yīng);對STX的敏感參數(shù)為BR，檢出限為0.09 ng/mL，檢測范圍為0.25～20 nM和0.18～14.6μM;對TTX的敏感參數(shù)為BR，檢出限為89

9、ng/mL，檢測范圍為0.4～20μM。該阻抗傳感器實現(xiàn)了STX高通量高靈敏檢測。心肌細胞電位傳感器法具有通量高、檢出限低、重復(fù)性好等優(yōu)點，有望成為新型高通量的離子通道類海洋毒素檢測平臺。
　　4.提出了快速檢測石房蛤毒素(STX)、河豚毒素(TTX)和短裸甲藻毒素(PbTx-2)的心肌細胞電位傳感器檢測法
　　基于心肌細胞阻抗傳感器檢測法的研究基礎(chǔ)，本文將優(yōu)化后的單孔8通道無線心肌細胞電位傳感器應(yīng)用于離子通道類海洋毒素的毒

10、性評價，提出了一種新型快速的離子通道類海洋毒素功能性檢測法。我們同樣選擇STX、TTX、PbTx-2作為研究對象，通過分析毒素作用5 min后心肌細胞電位傳感器EFP信號特征參數(shù)（峰電位幅值SA、發(fā)放頻率FR、峰電位半時程SPD.50）的變化，得出該電位傳感器對STX和PbTx-2的敏感參數(shù)分別為FR和SPD50，檢出限分別為0.35 ng/mL和1.55 ng/mL檢測范圍均為1.56～400 nM;對TTX的敏感參數(shù)為FR，檢出限分