肽基精氨酸脫氨酶抑制劑對(duì)失血性休克相關(guān)急性肺損傷保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分:失血性休克大鼠中性粒細(xì)胞Cit H3表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：探討失血性休克(hemorrhagic shock,HS)時(shí)大鼠循環(huán)中中性粒細(xì)胞瓜氨酸化組蛋白3(citrullinize histone3，Cit H3)以及肺組織Cit H3表達(dá)變化。
　　方法：選用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，將大鼠分為兩組，失血性休克(HS）組和假手術(shù)(Sham)組

2、，HS組是將大鼠股動(dòng)靜脈穿刺、置管，10分鐘放血總血容量40％，建立HS模型。休克模型建立6小時(shí)后兩組動(dòng)物分離循環(huán)中中性粒細(xì)胞，Western blot測(cè)定中性粒細(xì)胞CitH3和總的組蛋白3(Total H3)表達(dá)量，免疫組化方法檢測(cè)肺組織Cit H3的表達(dá)。
　　結(jié)果：與假手術(shù)組(Sham)相比，HS組循環(huán)中性粒細(xì)胞的Cit H3蛋白表達(dá)量與Sham組比較有明顯升高(P＜0.05)，但兩組之間Total H3蛋白表達(dá)量無顯著的統(tǒng)

3、計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。免疫組化結(jié)果顯示Cit H3主要定位于細(xì)胞核中，呈棕色表達(dá)，HS組肺組織CitH3的表達(dá)較Sham組顯著升高。
　　結(jié)論：HS引起SD大鼠循環(huán)中性粒細(xì)胞及肺組織中CitH3表達(dá)增加。
　　第二部分:肽基精氨酸脫氨酶抑制劑YW3-56對(duì)失血性休克大鼠急性肺損傷及存活率影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：探討一種新型肽基精氨酸脫氨酶(Peptidylarginine deiminases，PADs)抑制劑Y

4、W3-56在失血性休克急性肺損傷模型中的保護(hù)作用。
　　方法：選用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，分為三組，假手術(shù)(Sham)組，失血性休克(HS)組和YW3-56處理組。Sham組不給予特殊處理;HS組為大鼠股動(dòng)靜脈穿刺、置管，建立HS模型;YW3-56處理組在大鼠造失血性休克模型成功后給予YW3-56(10 mg/kg)腹腔注射處理。非致死性休克模型:10分鐘放血量占全身血容量40％，大鼠飼養(yǎng)籠繼續(xù)繼續(xù)觀察6小時(shí)

5、后，處死，肺組織病理切片染色，ELISA法檢測(cè)血漿細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子-1(cytokine-inducedneutrophil chemoattractant-1，CINC-1)的水平?；瘜W(xué)比色法測(cè)定肺組織髓過氧化物酶(MPO)含量，Western blot檢測(cè)肺組織細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)的表達(dá)。致死性休克模型:40分鐘共放血血容量55％，開始10

6、分鐘放血量占全身血容量30％，剩余25％在30分鐘內(nèi)持續(xù)緩慢放血。大鼠飼養(yǎng)籠繼續(xù)繼續(xù)觀察12小時(shí)，并對(duì)各組動(dòng)物生存時(shí)間進(jìn)行記錄。
　　結(jié)果：與Sham組相比，HS模型組肺組織的CINC-1、ICAM-1含量和MPO活性顯著升高，YW3-56處理顯著降低HS模型組肺組織的CINC-1、ICAM-1含量和MPO活性;Sham組大鼠肺組織無明顯炎癥損傷表現(xiàn);HS模型組中大鼠肺組織中可見明顯細(xì)胞間質(zhì)水腫，出血，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁輕度增

7、厚的炎癥損傷改變;腹腔給予YW3-56(10 mg/kg)處理可顯著減輕HS引起的肺組織炎癥損傷程度(P＜0.05）。對(duì)兩組進(jìn)行致死性休克模型生存分析結(jié)果顯示12小時(shí)內(nèi)HS模型組生存率僅為20％，而YW3-56處理后HS模型組的生存率則有60％，明顯高于單純的HS模型組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：新型PADs抑制劑YW3-56可顯著降低HS大鼠肺組織CINC-1、ICAM-1的表達(dá)和MPO活性，進(jìn)而抑制HS相關(guān)性急性肺損傷，并明

8、顯提高失血性休克大鼠12h存活率。
　　第三部分:YW3-56對(duì)中性粒細(xì)胞Cit H3表達(dá)及NETs形成影響
　　目的：探討肽基精氨酸脫氨酶（Peptidylarginine deiminases，PADs）抑制劑YW3-56對(duì)中性粒細(xì)胞Cit H3表達(dá)及中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular networks，NETs)形成的影響。
　　方法：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:選用雄性Sprague-Da

9、wley(SD)大鼠，分為二組，失血性休克(HS)組和YW3-56處理組，建立HS模型;YW3-56處理組在大鼠造失血性休克模型成功后給予YW3-56(10 mg/kg)腹腔注射預(yù)處理。分離循環(huán)中中性粒細(xì)胞，Western blot測(cè)定中性粒細(xì)胞CitH3和總的組蛋白3(Total H3)表達(dá)量，免疫熒光檢測(cè)肺組織Cit H3、MPO表達(dá)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:培養(yǎng)HL-60細(xì)胞，并誘導(dǎo)分化為中性粒細(xì)胞樣細(xì)胞，分別給予鈣離子載體(calcium

10、ionophore)、內(nèi)毒素(LPS，200ng/ml)、缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/reoxygenation，H/R)誘導(dǎo)NETs形成以及陰性對(duì)照處理，并對(duì)各組給予YW3-56 (5μM)處理，Western blot檢測(cè)細(xì)胞Cit H3、Total H3、Cit H4、Total H4表達(dá)量變化，細(xì)胞免疫熒光以及共聚焦顯微鏡觀察NETs形成情況。
　　結(jié)果：Western blot結(jié)果提示HS模型組循環(huán)中中性粒細(xì)胞Cit H

11、3表達(dá)增多，給予肽基精氨酸脫氨酶抑制劑干預(yù)后Cit H3表達(dá)顯著下降。免疫熒光提示HS模型組肺組織Cit H3、MPO表達(dá)增多，NETs形成增加，給予肽基精氨酸脫氨酶抑制劑干預(yù)后Cit H3、MPO表達(dá)顯著下降，NETs形成降低。HL-60細(xì)胞可被全反式維甲酸(ATRA，1μM)誘導(dǎo)成中性粒細(xì)胞樣細(xì)胞，并經(jīng)calcium ionophore(鈣離子載體)、LPS、H/R處理后Cit H3、Cit H4表達(dá)增多，NETs形成增加，給予YW

12、3-56(5.0 μM)處理后，Cit H3、Cit H4表達(dá)顯著下降，NETs形成降低。
　　結(jié)論：新型PADs抑制劑YW3-56顯著減弱HS大鼠肺組織及循環(huán)中Cit H3表達(dá)和NETs的形成。在細(xì)胞水平，YW3-56明顯抑制組蛋白瓜氨酸化，抑制NETs形成，從而減輕炎癥反應(yīng)，可能是治療失血性相關(guān)導(dǎo)致急性肺損傷的機(jī)制之一。
　　第四部分:NETs對(duì)巨噬細(xì)胞促炎因子、趨化因子分泌的影響
　　目的：探討中性粒細(xì)胞胞外誘捕

13、網(wǎng)(neutrophil extracellular networks，NETs)對(duì)巨噬細(xì)胞促炎因子、趨化因子分泌的影響。
　　方法：體外培養(yǎng)HL-60細(xì)胞株，全反式維甲酸(ATRA，1μM)誘導(dǎo)分化為中性粒細(xì)胞樣細(xì)胞，后經(jīng)calcium ionophore刺激誘導(dǎo)，并用或不用YW3-56預(yù)處理，刺激后提取得到相當(dāng)于NETs混合物的液體，將NETs樣混合物刺激巨噬細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清腫瘤壞死因子-α(tumor ne

14、crosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子-1 (cytokine-inducedneutrophil chemoattractant-1，CINC-1)的水平。
　　結(jié)果：NETs刺激巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清的TNF-α、IL-6和CINC-1水平顯著升高(P＜0.05），經(jīng)YW3-56預(yù)處理得到的NETs混合液刺激巨噬細(xì)胞，TNF-α、IL

15、-6和CINC-1水平明顯低于相應(yīng)的未經(jīng)YW3-56預(yù)處理組。且給予Cit H3 Ab、Cit H4 Ab中和NETs中的成分，以及DNaseⅠ預(yù)處理，降解NETs，顯著降低NETs誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-6和CINC-1水平的升高。
　　結(jié)論：NETs能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞促炎因子TNF-α和IL-6的分泌以及趨化因子CINC-1的表達(dá)，YW3-56可以通過抑制NETs形成，從而減輕巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌;且通過中和NETs的