虎杖甙對產(chǎn)兔失血性休克后肺損傷保護作用的研究.pdf

1、產(chǎn)后出血是我國乃至全球孕產(chǎn)婦死亡的主要因為,每年估計約有14萬婦女死于產(chǎn)后出血。全球超過一半的孕產(chǎn)婦死亡發(fā)生在產(chǎn)后24小時內(nèi),死因為出血過多。產(chǎn)后出血除導致孕產(chǎn)婦死亡外,還可引起嚴重的并發(fā)癥,如急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)、凝血系統(tǒng)疾病和席漢氏綜合癥。休克和ARDS是圍產(chǎn)期婦女入住重癥監(jiān)護中心(Intensive Care Unit,ICU)的主要因為,分別占產(chǎn)科

2、ICU所有疾病的25％和19％。近年研究發(fā)現(xiàn),輸血作為失血性休克后的治療措施之一,本身也可以引起急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)即輸血相關性急性肺損傷。失血性休克后的ALI,病情發(fā)展迅速,容易進一步惡化發(fā)展為ARDS,繼而進展為多器官功能障礙綜合征,導致圍產(chǎn)期婦女死亡。如果能夠在糾正產(chǎn)后失血性休克的同時進行有效地器官保護,防止ARDS的發(fā)生,無疑將顯著改善患者的預后,降低孕產(chǎn)婦死亡率。
　　 ALI/AR

3、DS是在嚴重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等非心源性疾病過程中,肺毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞損傷造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫,導致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。目前普遍認為肺組織缺血.再灌注損傷、炎性細胞因子的網(wǎng)絡作用、腸道細菌/內(nèi)毒素移位是導致失血性休克后ALI的根本因為,但其確切的發(fā)病機制仍有待深入闡明。
　　 肺是失血性休克后缺血再灌注損傷最嚴重的器官,也是失血性休克后急性肺損傷的重要途徑。MDA是脂質(zhì)過氧化反應的終產(chǎn)物,可以

4、通過MDA含量的檢測反映缺血再灌注時體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生水平,間接了解組織缺血再灌注損傷程度。促炎因子(TNF-α,IL-1,IL-6等)的過度釋放與抑炎因子(IL-4、IL-10)的相對表達不足,導致促炎/抗炎的失衡在ALI/ARDS的發(fā)病過程起重要作用。
　　 虎杖甙(Polydatin,PD),又名白藜蘆醇甙,是從虎杖的根莖中提取的第4種單體,化學結構已確定為3,4’,5-三羥基3-單-D-葡糖甙。主要功效有祛風利濕,祛痰止

5、咳,清熱解毒,活血化瘀。中醫(yī)臨床用于治療肺熱咳嗽,濕熱黃疸,瘡癰腫毒,關節(jié)痹痛,經(jīng)閉經(jīng)痛,水火燙傷,跌打損傷等。趙克森等通過大量動物實驗表明,虎杖甙能明顯提高失血性休克和燒傷性休克動物的存活率,改善微循環(huán),減少白細胞貼壁黏著,還有增加心功能和增加脈壓的效應。2006年虎杖甙通過了國家食品藥品監(jiān)督管理局的評審,取得了臨床試驗的正式批件,成為我國為數(shù)不多的Ⅰ類新藥的臨床試驗批件,應用于失血性休克和燒傷性休克的臨床研究。目前已有動物實驗研究表

6、明,虎杖甙通過降低促炎因子的釋放,抑制肺組織磷脂酶A2的活性,減輕內(nèi)毒性休克后的肺損傷,但未見虎杖甙對失血性休克后肺損傷的研究報道。
　　 基于孕產(chǎn)婦血容量高、血液高凝、肺功能殘氣量及氧合功能的降低,產(chǎn)后出血導致的失血性休克與非妊娠期失血性休克后的急性肺損傷可能有不同之處。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在出血未控制條件下,限制性輸液聯(lián)合應用虎杖甙復蘇孕兔失血性休克較單純應用限制性輸液能改善微循環(huán),延長動物生存時間,我們推測此藥物能改善產(chǎn)兔失血

7、性休克后的肺損傷的嚴重程度。
　　 [目的]
　　 1 建立產(chǎn)兔失血性休克后急性肺損傷模型,通過研究缺血-再灌注損傷、NF-κB介導的炎癥反應,多性核中性粒細胞的活化,探討產(chǎn)兔失血性休克后急性肺損傷的發(fā)生機制。
　　 2 證實虎杖甙對產(chǎn)兔休克后急性肺損傷的保護作用,通過研究熱休克蛋白,NF-κB,ICAM-1等,闡明虎杖甙對休克后急性肺損傷保護作用的的分子機制。
　　 3 探討虎杖甙對產(chǎn)兔休克后肝腎功能的

8、影響,評價藥物應用于產(chǎn)兔休克后的安全性,為日后應用于臨床研究提供理論依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1、實驗動物
　　 40只孕晚期新西蘭白兔,年齡2-2.5歲,妊娠年齡25-30天,產(chǎn)后6小時建立動物失血性休克模型。
　　 2、建立產(chǎn)兔失血性休克模型
　　 經(jīng)過麻醉動物、備皮、股動靜脈插管,操作完畢后15分鐘后,連續(xù)監(jiān)測平均動脈壓(Mean arterial pressure,MAP),記錄基礎期

9、指標。模型分為2期。①休克期(T0～T60min):動物自股動脈放血開始時間為T0,右側(cè)股動脈放血,速度2ml/kg/min,約15分鐘MAP降至40-45minHg,維持45分鐘,放出的血液經(jīng)肝素化處理以備回輸。②復蘇期(T60～T360min):股動脈放血后第60min(T60),生理鹽水與虎杖甙組分別輸入4ml/Kg生理鹽水與虎杖甙(1mg/ml),20分鐘后回輸自身血(股動脈失血量的一半)。T360停止實驗。拔除動物各管道,縫合

10、股動靜脈,縫合皮膚,放回籠內(nèi),自由飲水、進食,記錄動物存活時間。ALI診斷標準為PaO2/FiO2<300 mmHg。
　　 3、實驗分組
　　 將實驗動物編號,隨機分為4組,每組10只。①假休克組(Sham shock group:SS):動物僅接受麻醉、插管監(jiān)測血壓,未接受休克及復蘇處理；②休克組(Shockgroup:SH):動物接受麻醉、插管、休克處理,未予任何復蘇； ③生理鹽水組(Normal saline g

11、roup,NS):T60,靜脈注射生理鹽水4ml/Kg,20分鐘后回輸自身血(股動脈失血量的一半)；④虎杖甙組(Polydatin group,PD):T60,靜脈注射4ml/kg虎杖甙(1mg/ml),20分鐘后回輸自身血(股動脈失血量的一半)。
　　 4、監(jiān)測指標
　　 4.1持續(xù)監(jiān)測血流動力學指標:MAP
　　 4.2分別于T0(基礎期)、T60(放血后60min)、T80(給藥后20min)、T360(輸

12、血后280min)取股動脈血檢測紅細胞比容(hematocrit,Hct)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、肌酐(Creatinine,Cr)、PaO2、PaCO2、PaO2/FiO2、pH、乳酸、腫瘤壞死因子-alpha(TNF-α),白介素-10(IL-10)。Hct的測定采用微量血液離心機(金壇市正基儀器有限公司),ALT、Cr采用全自動生化分析儀檢測。PaO2、PaCO2、pH的檢測采用全自

13、動血氣分析儀(Medica Easy Blood GasAnalyzer,Medica Corporaton,U.S.A.)。乳酸試劑盒購于南京建成生物工程研究所。TNF-α、IL-10檢測采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)。TNF-α,IL-10試劑盒購于(R&D Systems,Minneapolis,MN；Biosource International,Camarillo,CA),空氣中氧含量為21％,定義FiO2=21％,計算P

14、aO2/FiO2。
　　 4.3肺組織檢測:SH組在休克后2-3h死亡,立即取肺組織。其余3組動物在實驗6h過程中均存活,于T360min,每組隨機取3只動物行安樂死,注射過量戊巴比妥鈉,取肺組織。具體如下:左肺下葉組織福爾馬林固定、石蠟包埋、切片、HE染色。光鏡下觀察肺間質(zhì)水腫及白細胞浸潤程度。左肺上葉-80℃凍存,行肺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性,丙二醛(Malondialdehyde,MD

15、A)含量,細胞間粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)mRNA與熱休克蛋白70[Heat Shock Protein(HSP)-70]的表達、NF-κB的表達及其結合力的檢測,右肺行濕,干質(zhì)量比(Wet/dry Weight,WW/DW)檢測。MPO、MDA試劑盒分別購于南京建成生物工程研究所。ICAM-1 mRNA的檢測采用TRIzol法提取總RNA,SYBR Green I實

16、時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR。Trizol試劑盒[美國MolecularResearch Center(MRC)公司],第一鏈cDNA合成試劑盒以及熒光定量試劑盒(RevertAidaTM First Strand cDNA Synthesis Kit,MaximTM SYBR Green/ROXqPCR Master Mix 2×,Fermentas)。肺組織HSP-70、NF-κB的表達采用WesternBlot方法,內(nèi)對照選擇β-actin

17、。肺組織HSP-70單克隆抗體(SPA-antibody,Stressgen Bioreagents Co,Ann Arbor,MI),NF-κB p65(NeoMarkers,Thermo FisherScientific,Fremont,CA,USA),β-actin(NeoMarkers,Thermo Fisher Scientific,Fremont,CA,USA)。NF-κB結合力檢測采用ELISA方法。NF-κB結合力購于(

18、Cayman Chemical Company,Ann Arbor,MI)。
　　 4.4肝腎組織行病理切片,HE染色
　　 4.5統(tǒng)計出血量及輸血量
　　 4.6產(chǎn)兔生存時間。
　　 5 統(tǒng)計學分析
　　 [結論]
　　 虎杖甙對產(chǎn)兔失血性復蘇后的肺損傷存在保護作用,可能與其減輕缺血再灌注損傷,增強肺組織HSP-70的表達,從而抑制肺組織NF-κB的激活,降低血清TNF-α的釋放以及肺組