核因子Kappa-B p65反義寡核苷酸對人晶狀體上皮細胞移行和轉(zhuǎn)分化的影響及其抑制后發(fā)性白內(nèi)障的實驗研究.pdf

1、目的:1、體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞株HLE B-3，觀察TGF-β2對晶狀體上皮細胞的移行和轉(zhuǎn)分化的影響。
　　2、觀察不同濃度的NF-κB p65ASODN和不同劑量的轉(zhuǎn)染劑HiPerFect對晶狀體上皮細胞的影響。
　　3、通過應(yīng)用NF-κB p65ASODN在體外轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細胞，檢測其對由TGF-β2誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞的移行和轉(zhuǎn)分化的影響，研究NF-κB p65ASODN在體外對晶狀體上皮細胞的影響。
　

2、　4、采用眼前房內(nèi)注射法轉(zhuǎn)移NF-κB p65ASODN至新西蘭大白兔后發(fā)性白內(nèi)障模型眼內(nèi)，觀察其對后發(fā)性白內(nèi)障的作用，探討后發(fā)性白內(nèi)障的基因治療方法。
　　方法:1、體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞株HLE B-3，用不同濃度的TGF-β2處理后，在不同的時間點用細胞劃痕法觀察細胞的移行能力，ELISA法處理細胞爬片后，檢測細胞爬片中的陽性細胞數(shù)和吸光度值，檢測α-SMA蛋白的變化。
　　2、將NF-κB p65ASODN行全程硫

3、代磷酸化修飾，不同濃度的NF-κB p65ASODN和不同劑量的轉(zhuǎn)染劑HiPerFect兩兩混合，探討細胞活性不受明顯影響的情況下，最佳的轉(zhuǎn)染效率時所需的NF-κB p65ASODN的濃度和轉(zhuǎn)染劑的劑量。
　　3、細胞同步培養(yǎng)后分五組:(1)空白對照組（單純FSM培養(yǎng)），(2)陰性對照組(HiPerFect轉(zhuǎn)染試加入到FSM中共同培養(yǎng))，(3)TGF-β2組（T組）(10ng/ml TGF-β2)，(4)TGF-β2加ASODN組

4、（T+A組）(TGF-β2、HiPerFect轉(zhuǎn)染試和ASODN加入到FSM中共同培養(yǎng))，(5)TGF-β2加MSODN組（T+M組）(TGF-β2、HiPerFect轉(zhuǎn)染試和MSODN加入到FSM中共同培養(yǎng))。不同組細胞繼續(xù)培養(yǎng)，6h、12h、24h、48h四個不同時間點收集上清液檢測α-SMA的含量，采用RT-PCR檢測細胞NF-κB mRNA的表達情況。
　　4、將16只新西蘭大白兔進行晶狀體囊外摘除術(shù)制作后發(fā)障活體眼動物模

5、型，手術(shù)后隨即分為四組，每組4只。A組:空白對照組4只白兔8眼:術(shù)畢經(jīng)側(cè)切口向前房注射BSS液100ul;B組:陰性對照組4只白兔8眼:術(shù)畢經(jīng)側(cè)切口向前房注射含3ul HiPerFect的BSS液100ul;C組:ASODN一次注射組4只白兔8眼:術(shù)畢經(jīng)側(cè)切口向前房注射含3ul HiPerFect和10nmol/L的NF-κB p65ASODN的BSS液100ul;D組:ASODN兩次注射組4只白兔8眼:術(shù)畢和術(shù)后第2天分別經(jīng)側(cè)切口向前

6、房注射含3ul HiPerFect和10nmol/L的NF-κB p65ASODN的BSS液100ul。術(shù)后第7、14、21、28天用超聲角膜測厚儀測量中央角膜厚度，用裂隙燈顯微鏡觀察前房炎癥反應(yīng)和后囊膜的混濁情況，并于實驗結(jié)束時行HE染色觀察后囊膜的病理變化、檢測α-SMA的表達和進行RT-PCR檢測晶狀體上皮細胞中NF-κB p65mRNA的表達。
　　結(jié)果:1、TGF-β2是晶狀體上皮細胞重要的促移行和轉(zhuǎn)分化生長因子，其作用

7、呈現(xiàn)明顯的濃度和時間依賴性。不同濃度的TGF-β2作用48h后，移行距離隨著TGF-β2濃度的增加而增加，當(dāng)濃度為10ng/ml時作用最強;晶狀體上皮細胞在10ng/ml TGF-β2作用下，其移行距離隨著作用時間的延長而增加，在48h達到高峰。晶狀體上皮細胞在TGF-β2作用下由單層立方形變?yōu)殚L梭形，伸出偽足，逐漸呈現(xiàn)纖維細胞樣形態(tài)。不同濃度的TGF-β2作用48h后，細胞爬片中α-SMA的陽性細胞數(shù)和吸光度值隨著TGF-β2濃度的增

8、加而增加，當(dāng)濃度為10ng/ml時數(shù)值最大;晶狀體上皮細胞在10ng/ml TGF-β2作用下，細胞爬片中α-SMA的陽性細胞數(shù)和吸光度值隨著作用時間的延長而增加，在48h達到最大值。
　　2、NF-κB p65ASODN對HLE B-3細胞的導(dǎo)入率隨時間的延長而增加，48h導(dǎo)入率可達60％以上，并且細胞的活性不受影響;隨著濃度增加，NF-κB p65ASODN對HLE B-3細胞的導(dǎo)入率增加，10μg/ml的轉(zhuǎn)染率最高，再增加濃

9、度轉(zhuǎn)染率增加不明顯，對細胞活性影響不明顯;當(dāng)劑量≤3ul時，隨著轉(zhuǎn)染劑HiPerFect的增加，對細胞的轉(zhuǎn)染率增加，無明顯細胞毒性，當(dāng)劑量增加為4u時，對細胞的轉(zhuǎn)染率增加不明顯，并且表現(xiàn)出細胞毒性。HiPerFect的劑量為3ul，ASODN的濃度為10nmol/L對細胞存活率影響小(80.4％)，同時細胞的轉(zhuǎn)染率可高達70.8％，為最理想轉(zhuǎn)染條件。
　　3、在6h、12h、24h、48h四個不同時間點與空白對照組相比，陰性對照組

10、、T組、T+A組、T+M組上清液α-SMA的濃度顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與陰性對照組相比，T組、T+M組上清液α-SMA的濃度顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;與陰性對照組相比，T+A組上清液α-SMA的濃度增加不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與T+A組相比，T組、T+M組上清液α-SMA的濃度顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;T組與T+M組上清液α-SMA的濃度之間的差異不

11、明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。NF-κB p65mRNA出現(xiàn)在364bp處。6h、12h、24h、48h四個不同時間點與空白對照組相比，陰性對照組、T組、T+A組、T+M組NF-κB p65mRNA的含量顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01);與陰性對照組相比，T組、T+M組NF-κB p65mRNA的含量顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;與陰性對照組相比，T+A組NF-κB p65mRNA的含量增加不明

12、顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;與T+A組相比，T組、T+M組NF-κB p65mRNA的含量顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;T組與T+M組NF-κB p65mRNA的含量之間的差異不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　4、眼前節(jié)炎癥反應(yīng)均在一周內(nèi)消失，組間無統(tǒng)計學(xué)差異。術(shù)后1周左右，A、B組開始出現(xiàn)后囊膜混濁，隨時間延長而逐漸加重，C、D組后囊混濁發(fā)生時間均遲于A、B組，混濁程度也較A、B組為輕，

13、差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。C、D組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HE染色后觀察到A、B組后囊表面可見多層成纖維細胞生長，細胞排列較為緊密，囊袋周邊部皮質(zhì)增生，同時可見明顯纖維素樣物質(zhì)沉積，C、D組后囊表面相對干凈，僅有少量細胞增殖，細胞排列較為疏松。A、B組后囊膜α-SMA的表達量較C、D組明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義;A組和B組之間，C組和D組之間差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義。RT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)A、B組NF-κB p65mRN

14、A的表達量較C、D組明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義;A組和B組之間，C組和D組之間差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:1、TGF-β2可促進晶狀體上皮細胞的移行，同時反應(yīng)細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的α-SMA蛋白的表達增加，應(yīng)用TGF-β2刺激體外培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞可成功建立后發(fā)障的細胞模型。
　　2、HiPerFect的劑量為3ul，ASODN的濃度為10nmol/L對細胞存活率影響小(80.4％)，同時細胞的轉(zhuǎn)染率可高達70.8