血漿Aβ抗體測定方法的建立及不同獻漿群體Aβ抗體水平的初步分析.pdf

1、目的:建立準確的血漿β-淀粉樣蛋白42(β-amyloid42，Aβ42)寡聚體抗體酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法，用于獻漿人群Aβ42抗體含量篩查。為制備富含Aβ42抗體的特異性靜脈注射免疫球蛋白(Intravenous Immunoglobulin，IVIg)奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1.利用人工合成的Aβ42肽段在不同起始聚合濃度及磷酸鹽緩沖液（Phosph

2、ate Buffered Saline，PBS）中添加0.05％十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)條件下制備Aβ42寡聚體，再通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot,WB)對制備的Aβ42寡聚體進行鑒定，從而篩選出較優(yōu)的合成方法。2.預(yù)實驗篩選出對ELISA檢測血漿Aβ42寡聚

3、體抗體影響較大的因素，設(shè)計正交實驗，確立檢測體系，并進行性能評估。3.檢測血漿樣本中Aβ42寡聚體抗體水平，分析其分布特征。
　　結(jié)果:1.Aβ42寡聚體生成量隨著Aβ42起始濃度的升高而增加。無SDS制備條件250、125及62.5μmol/L濃度的Aβ42下能生成三聚體及中、高分子量的寡聚體彌散帶;SDS制備條件250、125、62.5μmol/L濃度的Aβ42可生成三聚體及中等分子量的寡聚體。2.經(jīng)正交分析發(fā)現(xiàn)Aβ42寡聚體

4、包被濃度（0.2μg/孔）、包被pH(6.0)、包被離子濃度(0.01mol/L)、封閉液(15％BSA)、一抗（4℃/過夜）、二抗(1/2000、25℃/3h)條件組成的檢測體系效果更佳，相關(guān)系數(shù)為0.994;穩(wěn)定性相對偏差為3.5％、精密度相對偏差4.77％及準確性誤差為10.16％，均達到美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)及其他標準要求。3.

5、檢測四川、貴州兩地部分獻漿人血漿發(fā)現(xiàn)，女性Aβ42寡聚體抗體比男性高10.1％;Aβ42寡聚體抗體水平隨歲數(shù)增加呈增高的趨勢。貴州地區(qū)Aβ42寡聚體抗體水平比四川地區(qū)高25.0％;ABO血型差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，貴州地區(qū)高值樣本比例高于四川地區(qū)。
　　結(jié)論:1.適合的起始聚合濃度有利于Aβ42寡聚體的生成。PBS中添加0.05％的SDS有利于生成穩(wěn)定的Aβ42寡聚體。2.正交所得的ELISA檢測體系性能穩(wěn)定，能用于樣本血漿檢測。