β-巰基乙醇在骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元分化和H2O2誘導(dǎo)的凋亡中的作用及其機制的研究.pdf

1、目的:脊髓損傷多由于物理創(chuàng)傷引起，是一種會導(dǎo)致脊髓損傷支配平面以下的肢體功能喪失的一種的損傷。脊髓損傷可能發(fā)生于脊髓的各個節(jié)段，可分為完全損傷和不完全損傷，表現(xiàn)為不同程度的感覺功能、運動功能以及各種生理反射的異?；蛘邌适?。干細胞的移植，能夠在一定程度地改善損傷脊髓的功能，但是受限于被移植細胞的分化率，治療效果并不理想，更達不到臨床應(yīng)用的水準。骨髓間充質(zhì)干細胞易于分離獲得、增殖迅速、免疫原性低并具有跨胚層分化的潛能。骨髓間充質(zhì)干細胞一種是

2、多能干細胞，具有體外增值能力，還有分化為骨、肌肉、神經(jīng)等多種胚層來源細胞的潛在能力。某些抗氧化劑能夠促進骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元細胞分化。正常產(chǎn)生的活性氧會在自由基清除酶和抗氧化劑的參與下被清除。在很多條件下，活性氧還參與了調(diào)節(jié)多種諸如細胞增殖、細胞分化等細胞的生理過程。大量的活性氧不能被體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)和細胞內(nèi)的小分子抗氧化劑及時清除，就會造成細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細胞的凋亡、壞死。有效地控制活性氧水平能夠抑制細胞的凋亡，促進干細

3、胞分化，繼而提高骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療脊髓損傷的療效。
　　研究方法:本研究中我們將實驗分為兩部分。第一部分中，在體外培養(yǎng)了大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，用β-巰基乙醇誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元細胞分化，采用鏡下觀察以及神經(jīng)元特異性標記物檢測來確定細胞的分化。以空白對照組和H2O2處理組與β-巰基乙醇誘導(dǎo)組進行細胞內(nèi)活性氧水平的測定，以及相關(guān)通路的表達測定，尋找Notch1信號通路與活性氧濃度之間的關(guān)系。在第二部的實驗中，們用H2O2

4、誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞發(fā)生凋亡，并用H2O2/β-巰基乙醇共同處理細胞，來發(fā)現(xiàn)β-巰基乙醇對凋亡的抑制作用。通過光鏡，熒光顯微鏡以及流式細胞儀檢測的方法，對比各組之間凋亡的差異。對比各組之間的細胞內(nèi)活性氧水平，以及凋亡相關(guān)通路，來探究β-巰基乙醇抗凋亡的機制。
　　結(jié)果:β-巰基乙醇誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元細胞分化，倒置相差鏡下觀察，BMSCs的細胞質(zhì)逐漸向細胞核收縮，細胞體逐漸向多極形狀變化，并軸向向遠端延伸。倒置熒光顯微鏡下

5、，誘導(dǎo)5小時后的BMSCs細胞質(zhì)呈現(xiàn)出NSE的高表達。Western blot分析:NSE的表達隨著處理時間的加長升高。Nestin的表達隨著處理時間的加長升高。Notch1的表達隨著處理時間的加長降低。檢測β-巰基乙醇對細胞內(nèi)的ROS水平的作用，DCFH-DA測定:β-巰基乙醇能夠降低細胞內(nèi)的ROS水平，H2O2能夠提高細胞內(nèi)的ROS水平。Western blot分析:Notch1和Hes1的表達與ROS的水平正相關(guān)。H2O2誘導(dǎo)BM

6、SCs凋亡，β-巰基乙醇抑制凋亡。倒置相差顯微鏡下觀察:H2O2處理組中的細胞視野當中可見大量體積縮小、亮度增加的凋亡細胞。 H2O2/β-巰基乙醇共同處理的體積縮小、亮度增加的凋亡細胞數(shù)量較H2O2處理組明顯下降。Hoechst33258染色:H2O2處理組中的細胞視野當中可見大量細胞核致密濃染或呈碎塊濃染的凋亡狀態(tài)。而H2O2/β-巰基乙醇共同處理的凋亡細胞數(shù)量較H2O2處理組明顯下降了。流式雙染細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況:H2O2處理

7、組與空白對照組相比，細胞凋亡率明顯上升了。H2O2/β-巰基乙醇共同處理組與H2O2處理組相比，細胞凋亡率明顯下降了。DCFH-DA測定:H2O2能夠提高細胞內(nèi)的ROS水平。H2O2/β-巰基乙醇共同處理組ROS比H2O2處理組降低了。Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達，與空白對照組相比，H2O2處理組的Bax和caspase3的表達上升了，而抑制凋亡的Bcl-2的表達下降了。H2O2/β-巰基乙醇共同處理組與H2O2處理組相比

8、，Bax和caspase3的表達下降了，而抑制凋亡的Bcl-2的表達上升了。Akt表達沒有明顯差異。與空白對照組相比，H2O2處理組的p-Akt的表達下降了。H2O2/β-巰基乙醇共同處理組與H2O2處理組相比p-Akt的表達上升了。
　　結(jié)論:β-巰基乙醇作為一種抗氧化劑，在適當?shù)臐舛认履軌蛟隗w外促進骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元細胞分化，這一過程與細胞內(nèi)活性氧的下降，Notch1信號通路抑制，Hes1基因表達下降有關(guān)。β-巰基乙醇能