CS-PAA@TPGS-PLGA納米核遞藥系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)肺癌細胞多藥耐藥的效應(yīng)及機制研究.pdf

1、背景：
　　癌癥是一類嚴重危害人類生命健康的常見疾病。近年來，納米藥物輸送系統(tǒng)(nano-drug delivery system，NDDS)因其具有滲透性、靶向性、控制藥物釋放和提高藥物溶解度等優(yōu)點，在癌癥治療中得到廣泛關(guān)注和應(yīng)用。然而，目前多數(shù)的研究僅將藥物遞送到癌細胞的胞質(zhì)使其釋放成游離狀態(tài)，即已達目的。但大部分抗癌藥物，如鬼臼毒素(VP-16)和順鉑，是通過破壞細胞核內(nèi)的DNA或者抑制拓撲異構(gòu)酶引起細胞凋亡而發(fā)生作用。藥物

2、進入到細胞質(zhì)成游離狀態(tài)，屬于P-gp底物的抗癌藥物，有可能被外排至細胞外，從而降低抗癌效應(yīng);此外，也可能在胞質(zhì)內(nèi)受降解而作用減弱，或被溶酶體隔離不能入核，從而導致多藥耐藥(MDR)。
　　通過納米顆粒將藥物靶向遞送到細胞核內(nèi)以逆轉(zhuǎn)多藥耐藥成為研究熱點。正常的細胞與腫瘤細胞有著不同的pH環(huán)境，血液及正常細胞的pH值為中性與弱堿性，約為7.4，而腫瘤細胞間質(zhì)為弱酸性環(huán)境，均值為5.8。腫瘤細胞胞質(zhì)中內(nèi)涵體(endosome)和溶酶體(

3、lysosome)為更強的酸性環(huán)境，pH值約為5.0，甚至可低至4.0，而在細胞核中，無論正常細胞或癌細胞，其pH值均為弱堿性，約為7.4?；谝陨霞毎麅?nèi)不同的pH梯度，研究開發(fā)pH敏感的抗癌藥物輸送載體可以明顯增加藥物在作用部位如細胞質(zhì)和細胞核中的濃度，逆轉(zhuǎn)癌細胞的多種抗藥機制，從而提高抗癌藥物的治療效率并減少其毒副作用。
　　實驗?zāi)康模?br>　　設(shè)計和制備一種新型的納米遞藥系統(tǒng)CS/PAA/VP-16@TPGS/PLGA N

4、Ps，這種納米系統(tǒng)是由許多較小載VP-16的殼聚糖/聚炳烯酸共聚物納米顆粒(CS/PAA/VP-16 NPs)裝載到生育酚聚乙二醇琥珀酸鹽(TPGS)乳化的乳酸-羥基乙酸(TPGS/PLGA NPs)大納米顆粒中組成的，其中VP-16作為模式藥物。對該納米顆粒進行了理化表征，驗證了pH敏感的釋放特性，研究該納米顆粒在體外對耐藥細胞株的抗癌活力，同時觀察納米顆粒的入胞情況和胞內(nèi)遷移特性以及分析納米顆粒載體的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的機理。
　　

5、實驗方法：
　　1.制備表征:采用點滴法制備CS/PAA NPs并將模式藥物VP-16吸附到小納米顆粒內(nèi)形成載藥的CS/PAA/VP-16 NPs。利用同軸系統(tǒng)并采用復乳化(W/O/W)原理將CS/PAA/VP-16 NPs裝載到TPGS/PLGA NPs大納米顆粒中。粒度及表面電位分析儀、掃描電鏡測定CS/PAANPs，CS/PAA/VP-16 NPs， CS/PAA@TPGS/PLGA NPs,CS/PAA/VP-16@TPG

6、S/PLGA NPs的粒徑、Zeta電位和表面形態(tài);采用透射電子顯微鏡和激光共聚焦電子顯微鏡驗證CS/PAA@TPGS/PLGA NPs的大包小特殊結(jié)構(gòu)。X射線衍射(XRD)、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)檢測納米粒的理化結(jié)構(gòu);紫外分光光度法測定納米粒的包封率、載藥量和藥物體外釋放特性。
　　2.生物效應(yīng):利用WST-1試劑盒測定VP-16、CS/PAA/VP-16 NPs、CS/PAA/VP-16@TPGS/PLGA NPs對A

7、549/DDP細胞的毒性，并計算IC50值。采用WST-1方法測定CS/PAA NPs和CS/PAA@TPGS/PLGA NPs材料的安全性。使用AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒進行凋亡檢測。
　　3.細胞攝取和遷移:制備細胞膜綠色熒光探針(Dio)標記的TPGS/PLGA NPs、羅丹明-123(Rh-123)標記的CS/PAA NPs及CS/PAA/Rh-123@TPGS/PLGA/DioNPs，與游離的Rh-123進行

8、對比，使用共聚焦顯微鏡觀察納米顆粒入胞和細胞內(nèi)遷移的情況。
　　4.機理研究:以CS/PAA@TPGS/PLGA/Dio NPs、CS/PAA/Rh-123@TPGS/PLGANPs、紅色熒光探針和綠色熒光探針標記溶酶體，采用共聚焦顯微鏡觀察CS/PAA@TPGS/PLGA NPs入胞后的降解情況和TPGS/PLGA NPs外層納米顆粒，CS/PAA NPs內(nèi)層小納米顆粒與溶酶體及細胞核的位置關(guān)系。利用透射電鏡觀察經(jīng)CS/PAA@

9、TPGS/PLGA NPs處理不同時間后A549/DDP細胞內(nèi)各細胞器的變化，并用單丹磺酰戊二胺(MDC)染色法檢測自噬的發(fā)生。
　　結(jié)果：
　　1.本課題制備的CS/PAA NPs，CS/PAA/VP-16 NPs呈球形，粒徑為30nm左右，將CS/PAA NPs，CS/PAA/VP-16 NPs裝載到TPGS/PLGA NPs中得到的CS/PAA@TPGS/PLGA NPs和CS/PAA/VP-16@TPGS/PLGA

10、NPs粒徑為300nm左右。整個遞藥系統(tǒng)S@L NPs的表面電荷為負，包封率為91.7％，載藥量為1.35％。透射電鏡和激光共聚焦結(jié)果表明CS/PAA NPs封裝到TPGS/PLGA NPs中。DSC、XRD、FTIR進一步證明S@L NPs的成功合成和模式藥的成功封裝。體外釋放特性顯示S@L NPs在酸性環(huán)境下外層TPGS/PLGA NPs破壞釋放出CS/PAA NPs，而在弱堿性環(huán)境下穩(wěn)定存在。CS/PAA/VP-16 NPs體外藥

11、物釋放結(jié)果顯示，在酸性條件下藥物很少釋放，而在弱堿性環(huán)境下釋放較好。從而證明了S@L NPs的pH敏感釋放特性。
　　2.WST-1實驗結(jié)果顯示，CS/PAA/VP-16@TPGS/PLGA NPs對A549/DDP細胞的毒性明顯高于CS/PAA/VP-16 NPs和游離VP-16的細胞毒性。對材料毒性測試顯示，只有在材料濃度2mg/ml時，具有明顯的細胞毒性。在濃度為1mg/ml時顯示較低的細胞毒性，并且AnnexinⅤ-FIT

12、C/PI檢測結(jié)果顯示， CS/PAA@TPGS/PLGA NPs濃度為1mg/ml時所引起的細胞死亡，大都以細胞凋亡形式引發(fā)的，證明了材料的安全性。
　　3.激光共聚焦細胞遷移途徑結(jié)果顯示， CS/PAA/Rh-123@TPGS/PLGA/Dio NPs能夠經(jīng)過細胞膜進入細胞質(zhì)，隨后在細胞質(zhì)中釋放出小納米顆粒CS/PAA/Rh-123 NPs，CS/PAA/Rh-123 NPs能夠經(jīng)過核孔進而將Rh-123遞送到細胞核內(nèi)。而游離的

13、Rh-123組，在細胞核內(nèi)幾乎沒有紅色熒光出現(xiàn)。
　　4.逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的機制研究結(jié)果顯示，CS/PAA@TPGS/PLGA NPs經(jīng)過內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)，進而CS/PAA@TPGS/PLGA NPs在溶酶體的酸性環(huán)境下外層的TPGS/PLGA NPs被破壞，釋放出CS/PAA NPs。CS/PAA NPs能夠逃脫溶酶體經(jīng)核孔進入細胞核，而TPGS/PLGA NPs的碎片被滯留在細胞質(zhì)或溶酶體中，引發(fā)自噬，增強了細胞毒性。