維通注射劑對腹膜成纖維細胞的影響及組方研究.pdf

1、研究背景：
　　 術后組織粘連是結締組織纖維帶和相鄰組織或器官結合在一起而形成的異常結構。從外科手術開展到現(xiàn)在,術后粘連的形成就成為一個棘手的問題。腹部粘連是腹部手術后常見的并發(fā)癥,可引起粘連性腸梗阻、女性不育和腹盆腔慢性疼痛等疾病,除了給病人帶來痛苦,其經(jīng)濟代價也是高昂的。但是臨床上至今尚無安全、有效、方便的防治腹部術后粘連的藥物和方法。近年來,隨著中醫(yī)藥研究的快速發(fā)展,很多中藥被應用到臨床防治術后粘連。中藥有獨特的優(yōu)勢,如多

2、靶點發(fā)揮療效、毒副作用小、易被患者接受等,成為防治術后粘連的一個重要途徑,有較好的研究前景和開發(fā)價值。
　　 WTI是南方醫(yī)院藥學部在常通口服液研究的基礎上,研制出的中藥粉針劑型。其主要活性成分由中藥D和皂苷Q組成(D、Q質量比為1:1),具有改善微循環(huán)、抑制炎癥反應、抗?jié)B出的藥理功效,臨床上主要用于防治術后粘連。WTI具有起效迅速且不受術后禁食期限制等優(yōu)點,可在腹部手術后早期使用,可能成為術后粘連防治體系中的又一個重要新藥。<

3、br>　　 目的：
　　 從細胞分子水平探討WTI主要成分防治術后粘連的作用機制,觀察D和Q對體外培養(yǎng)的正常腹膜和粘連腹膜FB的影響;在體外定量分析WTI中D和Q聯(lián)合應用的協(xié)同、相加或拮抗作用；確定D和Q的最佳配比組方并研究其對FB的影響,證實最佳配比組方的合理性,為該藥的開發(fā)應用提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。
　　 方法：
　　 1大鼠正常腹膜及粘連腹膜FB的體外培養(yǎng)與鑒定
　　 制備大鼠術后粘連模型,采用

4、組織塊貼壁法培養(yǎng)FB,待細胞從組織塊中長出并且融合成致密單層后,用胰蛋白酶消化,以1:3傳代。本實驗選用的FB為第3～8代。倒置相差顯微鏡下觀察FB形態(tài),并對培養(yǎng)的FB進行波形蛋白免疫組化鑒定。
　　 2 WTI主要成分對正常腹膜與粘連腹膜FB增殖的作用研究
　　 2.1 WTI主要成分對正常腹膜與粘連腹膜FB增殖活性的作用
　　 取生長狀態(tài)良好的NFB與AFB,分別接種至96孔板,每種細胞均設D、Q、D+Q3個

5、組,每組均設6個藥物處理濃度,分別為4、8、16、32、64、128μg/ml,D+Q組的藥液按照WTI中D與Q的質量比配制(D:Q=1:1)。正常對照組加不含藥物的培養(yǎng)液200μl,以不含F(xiàn)B的培養(yǎng)液作空白對照,培養(yǎng)72h后,MTT法測定各孔吸光度,計算各個濃度下的生長抑制率(IR),并求出各藥的半數(shù)抑制率(IC50),利用中效原理判斷聯(lián)合用藥對NFB和AFB的效應。
　　 2.2 WTI主要成分對正常腹膜與粘連腹膜FB膠原合

6、成的影響
　　 取處于對數(shù)生長期的NFB與AFB,24孔培養(yǎng)板每孔加入3×104個/ml的FB1 ml,每種細胞均設D、Q兩組,分別加入含終濃度為24、48、96μg/ml的D培養(yǎng)液和終濃度為16、32、64μg/ml的Q培養(yǎng)液。加藥后72 h測定培養(yǎng)液中Hyp的含量,測定膠原合成水平。
　　 2.3 WTI主要成分對正常腹膜與粘連腹膜FB壞死的影響
　　 取對數(shù)生長期的NFB與AFB,24孔培養(yǎng)板培養(yǎng),每孔加入

7、3×104個細胞,培養(yǎng)72h后棄上清,每種細胞均設D、Q兩組,D、Q組分別加入終濃度為24、48、96μg/ml的D、Q培養(yǎng)液。48 h后取上清,用全自動生化分析儀測定LDH活性。
　　 2.4 WTI主要成分對正常腹膜與粘連腹膜FB細胞遷移的影響
　　 取處于對數(shù)生長期的NFB與AFB,以1×105/孔密度接種于已做好標記的6孔板,于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),每種細胞均設D、Q兩組。72 h待細胞融合后,建立

8、體外細胞劃痕創(chuàng)傷模型,D、Q兩組分別加入48μg/ml的D和Q,培養(yǎng)24 h后,觀察藥物對細胞遷移的影響。
　　 3 WTI主要成分的優(yōu)化配比研究
　　 采用與2.1相同的MTT方法檢測NFB和AFB細胞增殖活性,以細胞增殖抑制率作為考察指標。根據(jù)權重配方法初步實驗設不同配比組方6組,由結果分析得出最佳理論配比。在此基礎上進一步做確證性實驗考察兩組分的聯(lián)合作用。
　　 4 WTI的最佳組方對正常與粘連腹膜FB增殖

9、影響的研究
　　 4.1 D、Q最佳組方對正常腹膜與粘連腹膜FB增殖的影響
　　 取處于對數(shù)生長期的NFB與AFB,接種于96孔板,同時設陰性對照組,方法同2.1,培養(yǎng)24h后加入含有各濃度最佳組方的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h,再用MTT比色法測定吸光度值,計算出細胞生長抑制率。
　　 4.2 D、Q最佳組方對正常腹膜與粘連腹膜FB壞死的影響
　　 取處于對數(shù)生長期的NFB與AFB,接種于24孔板,同時設陰性

10、對照組,方法同2.3,加入含有各濃度最佳組方的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取上清,用全自動生化分析儀測定LDH活性。
　　 4.3 D、Q最佳組方對正常腹膜與粘連腹膜FB細胞遷移的影響
　　 取處于對數(shù)生長期的NFB與AFB,接種于6孔板,同時設陰性對照組,方法同2.4,加入含有48μg/ml最佳組方的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,劃痕實驗觀察藥物對細胞遷移的影響。
　　 4.4 D、Q最佳組方對正常腹膜與粘連腹膜FB細

11、胞周期的影響
　　 取處于對數(shù)生長期的NFB與AFB接種至培養(yǎng)皿中,設空白和最佳組方藥物組,其中藥物組的濃度為48μg/ml,在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72h,流式細胞術(FCM)檢測各組FB的細胞周期。
　　 4.5 D、Q最佳組方對正常腹膜與粘連腹膜FB分泌細胞因子的影響
　　 取對數(shù)生長期的NFB與AFB,用24孔培養(yǎng)板培養(yǎng),每孔加入3×104個細胞,24 h后吸棄培養(yǎng)液,加入終濃度為24、48、96μg/ml的

12、D、Q最佳組方培養(yǎng)液。正常對照組加不含藥物的培養(yǎng)液500μL。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后,收集培養(yǎng)上清液,用ELISA方法檢測FB細胞上清液中TNF-α、IFN—γ、IL-2的含量。
　　 結果：
　　 1 NFB和AFB在體外培養(yǎng)條件下均較易貼壁生長,AFB比NFB生長速度快。兩種細胞的波形蛋白免疫組化染色結果均為陽性。
　　 2 WTI主要成分對正常腹膜與粘連腹膜FB增殖的作用研究
　　 2.1 WTI主要成

13、分對正常腹膜與粘連腹膜FB增殖活性的作用
　　 D和Q單用或聯(lián)合應用對FB的生長均有顯著的增殖抑制作用,且呈劑量依賴性。當NFB組藥物效應大于0.6或AFB組藥物效應大于0.65時,兩藥聯(lián)用后具有協(xié)同作同(CI<1)。
　　 2.2 WTI主要成分對正常腹膜與粘連腹膜FB膠原合成的影響
　　 AFB空白組培養(yǎng)液的Hyp含量明顯高于NFB空白組(P<0.05)。但是2種FB的D、Q藥物組與空白對照組相比,其Hyp含

14、量均無顯著性差異(P>0.05)。
　　 2.3 WTI主要成分對正常腹膜與粘連腹膜FB壞死的影響
　　 隨著Q濃度的增加,NFB和AFB細胞LDH漏出率逐漸增大,且48μg/ml和96μg/ml濃度的Q組與空白對照組相比存在顯著性差異。而D只在96μg/ml時LDH漏出率與AFB空白對照組相比有顯著性差異。
　　 2.4 WTI主要成分對正常腹膜與粘連腹膜FB細胞遷移的影響
　　 NFB的對照組、D組和

15、Q組的細胞遷移率分別為8.7％±2.2％、2.2％±1.4％、2.7％±0.3％,AFB的對照組、D組和Q組的細胞遷移率分別為19.7％±1.6％、7.6％±1.6％和6.0％±1.4％,D、Q均可顯著抑制NFB和AFB的細胞遷移。
　　 3 WTI主要成分的優(yōu)化配比研究
　　 D在組方中量效關系相對明顯,為主藥,Q可能起到對主藥的協(xié)同或相加作用,二者最佳配比為9:2時,可非常顯著抑制FB的增殖。
　　 4 WT

16、I的最佳組方對正常與粘連腹膜FB增殖影響的研究
　　 4.1最佳組方對正常腹膜與粘連腹膜FB增殖活性的作用
　　 不同濃度的最佳組方作用于NFB和AFB72 h后,FB的增殖均有不同程度的抑制,濃度越大,其抑制效果越明顯。最佳組方以劑量依賴方式抑制FB的增殖。
　　 4.2最佳組方對正常腹膜與粘連腹膜FB壞死的作用
　　 最佳組方作用于NFB和AFB72h后,各藥物劑量組的培養(yǎng)上清中LDH活性與對照組之間

17、比較,結果無顯著性差異(P>0.05)。
　　 4.3最佳組方對正常腹膜與粘連腹膜FB細胞遷移的作用
　　 NFB對照組與藥物組的細胞遷移率分別為7.7％±1.5％和2.6％±1.7％。AFB對照組與藥物組的細胞遷移率分別為30.0％±7.1％和2.4％±1.1％,NFB和AFB的藥物組與對照組比較均有顯著性差異(P<0.001)。
　　 4.4最佳組方對正常腹膜與粘連腹膜FB細胞周期的影響
　　 NFB

18、和AFB藥物組的G0/G1期百分數(shù)顯著高于相應的空白組,S期的百分數(shù)則顯著低于相應的空白組,而G2/M期的百分數(shù)與相應的空白組相比無顯著性差異。
　　 4.5最佳組方對正常腹膜與粘連腹膜FB分泌細胞因子的影響
　　 不同濃度的藥物作用于NFB和AFB后,隨著藥物濃度增大,TNF-α和IFN-γ分泌量逐漸減少。而NFB和AFB分泌的IL-1,藥物組與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。
　　 結論：
　　

19、 1、組織塊培養(yǎng)法所獲得的FB可在體外穩(wěn)定培養(yǎng),這為在細胞水平上研究術后粘連預防的作用機制提供了充足、可靠的靶細胞。
　　 2、WTI主要成分D、Q對FB增殖和遷移有抑制作用,能降低FB活性,但是對膠原合成沒有影響,WTI中D和Q聯(lián)合應用對FB的增殖抑制具有協(xié)同作用。
　　 3、WTI主要成分D、Q的最佳組方配比為9:2。
　　 4、D、Q最佳組方在一定的劑量范圍內(nèi)對FB增殖和遷移有抑制作用,不會產(chǎn)生細胞毒性；