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文檔簡介
1、神經(jīng)源性疼痛(Neuropathic Pain)是由于神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)損傷或功能障礙而引起的疼痛綜合征,主要表現(xiàn)為痛覺過敏、異常痛敏和自發(fā)性疼痛等。神經(jīng)源性疼痛的發(fā)病機(jī)制不清,是當(dāng)今困擾人類較為嚴(yán)重的臨床問題之一。目前對神經(jīng)源性疼痛尚沒有特效的治療藥物,常用阿片類和中樞神經(jīng)抑制劑控制疼痛,但阿片類鎮(zhèn)痛藥對部分神經(jīng)源性疼痛幾乎無效,而作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物副作用較大,限制了藥物的劑量,使其不能達(dá)到有效的鎮(zhèn)痛作用。因而,探尋神經(jīng)源性疼痛的發(fā)
2、病機(jī)制,尋求作用于脊髓或外周部位、不具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用的藥物,顯得尤為迫切。
Mrgs(Mas-related genes)相關(guān)受體是2001年發(fā)現(xiàn)的一類與疼痛密切相關(guān)的新型G蛋白偶聯(lián)受體,其內(nèi)源性配體主要有阿片肽和神經(jīng)肽,由于阿片肽前體的水解片斷能高效激活Mrgs受體,產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用,所以被定義為外周阿片受體。Mrgs受體家族中大部分成員的mRNA都特異地、以非重疊形式表達(dá)于背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root gang
3、lion,DRG)的小直徑感覺神經(jīng)元上。這種特異性表達(dá)模式提示,該家族受體很可能成為研發(fā)無中樞副作用的鎮(zhèn)痛藥物的潛在靶點(diǎn)。
本研究選用大鼠神經(jīng)源性疼痛模型,探討外周阿片受體與疼痛的關(guān)系。Mrgs受體在大鼠體內(nèi)的亞型主要有MrgA、B、C、D等多種,其中MrgD亞型的表達(dá)量較多,尤其是在DRG非肽能、小直徑IB4+神經(jīng)元上表達(dá),與ATP門控離子通道腺苷受體(P2X3)和辣椒素受體(VR1)相互重疊分布。已有研究表明,P2X3
4、和VR1受體均參與了神經(jīng)源性痛的外周機(jī)制,那么MrgD受體也有可能參與了神經(jīng)源性痛的發(fā)病過程。因此,本研究以MrgD受體為靶標(biāo),觀察其在動物和細(xì)胞水平的表達(dá)變化。
研究目的:觀察在痛敏形成和發(fā)展過程中MrgD受體在DRG、脊髓和脊髓上水平表達(dá)的動態(tài)變化,以及不同類型的藥物干預(yù)對MrgD受體激動狀態(tài)的影響。
研究方法:建立大鼠神經(jīng)源性疼痛模型,用Von frey filament測定機(jī)械痛覺超敏和痛覺過敏,用熱
5、輻射刺激引起縮足的潛伏期代表對熱刺激的敏感程度,并以此來確定痛敏的形成;采用實(shí)時定量PCR和Western blot分析方法測定MrgD受體的表達(dá)量;將MrgD基因定向克隆于含有不同標(biāo)簽的真核表達(dá)載體,瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞,用細(xì)胞定位、免疫共沉淀等方法驗(yàn)證MrgD二聚體的形成。
研究結(jié)果:
1.建立了坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(CCI)模型、脊神經(jīng)結(jié)扎模型(SNL)和中樞神經(jīng)損傷強(qiáng)啡肽(DYN)模型。通過對三種神經(jīng)源性疼痛
6、動物模型綜合分析和比較,我們采用慢性壓迫坐骨神經(jīng)損傷(CCI)模型來研究MrgD受體和神經(jīng)源性疼痛的關(guān)系。
2.在CCI模型上進(jìn)行藥物治療,結(jié)果顯示,MrgD受體非選擇性激動劑BAM22P、阿片受體激動劑嗎啡和抗癲癇藥加巴噴丁均具有鎮(zhèn)痛作用,其中嗎啡作用最強(qiáng);同時給予BAM22P和阿片受體拮抗劑Naloxone,BAM22P仍顯示出鎮(zhèn)痛作用,其鎮(zhèn)痛作用可能是通過MrgD受體起作用的。
3.分析MrgD受體的表
7、達(dá)與神經(jīng)源性疼痛發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系。在正常動物DRG和脊髓上,我們發(fā)現(xiàn)MrgD受體以單體和二聚體兩種形式存在;在MrgD受體表達(dá)與神經(jīng)源性疼痛(CCI模型)的關(guān)系方面,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MrgD受體mRNA和蛋白在神經(jīng)源性疼痛的形成過程中均表達(dá)增加,其中造模3d時,DRGMrgD受體mRNA和蛋白表達(dá)量達(dá)到最高;造模7d時,脊髓MrgD受體mRNA和蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。以上結(jié)果說明MrgD受體的表達(dá)與神經(jīng)源性疼痛具有一定的相關(guān)性。當(dāng)用上述藥物干
8、預(yù)后,在BAM22P刺激作用下,MrgD受體單體和二聚體水平發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化,單體表達(dá)量升高,二聚體表達(dá)量下降。
4.構(gòu)建瞬時表達(dá)重組rMrgD受體的HEK293細(xì)胞株。利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù),從總RNA中擴(kuò)增出目的基因,克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1myc-hisB和pcMV-HA中,構(gòu)建真核表達(dá)rMrgD載體,瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞得到重組質(zhì)粒表達(dá)細(xì)胞株。通過免疫熒光和western blot方法對表達(dá)產(chǎn)物
9、進(jìn)行鑒定。直接和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)皆表明rMrgD主要定位于細(xì)胞膜上,western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)rMrgD在HEK293細(xì)胞主要以單體和二聚體形式存在;瞬時共轉(zhuǎn)帶有HA和myc標(biāo)簽的重組rMrgD質(zhì)粒,通過免疫共沉淀進(jìn)一步證實(shí)rMrgD自身能夠形成二聚體,這為進(jìn)一步研究MrgD受體的功能奠定了基礎(chǔ)。
5.在已建立的三種模型上對新型鎮(zhèn)痛藥Seselin及衍生物進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示,Seselin在CCI模型上的鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)
10、(48%),比對照藥阿司匹林(10%)強(qiáng),但比Gab(76%)弱;在SNL模型上Seselin的鎮(zhèn)痛作用較弱;在強(qiáng)啡肽模型上沒有明顯鎮(zhèn)痛作用。在SNL模型上對Seselin衍生物進(jìn)行藥效學(xué)初步評價(jià),其中三個化合物顯示出了比Seselin較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性,鎮(zhèn)痛活性還需進(jìn)一步評價(jià)。
結(jié)論:本研究從mRNA和蛋白水平首次證明MrgD受體在神經(jīng)源性疼痛的形成過程中發(fā)揮了重要作用,Mrgs受體非選擇性激動劑BAM22P具有鎮(zhèn)痛作用,作
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