EML4-ALK融合基因陽性人肺腺癌H2228細(xì)胞株對克唑替尼耐藥前后stat3-survivin信號通路的檢測.pdf

1、目的:探討EML4-ALK融合基因陽性人肺腺癌H2228細(xì)胞株對克唑替尼(crizotinib)耐藥前后stat3/survivin信號通路的變化及其調(diào)控機(jī)制。
　　方法:采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測克唑替尼對H2228細(xì)胞增殖的抑制作用，計算IC50;采用濃度梯度遞增法誘導(dǎo)H2228耐藥細(xì)胞株(H2228crizotinib resistance，H2228 CR)，并測定其耐藥指數(shù);采用流式細(xì)胞術(shù)檢測克唑替尼分別作用于H2228

2、親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞24 h、48 h、72 h后的凋亡率，用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot，WB)的方法檢測0 nmol/L、0.3 nmol/L及0 nmol/L、0.3 nmol/L、1μmol/L濃度的克唑替尼分別作用于H2228親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞72 h后p-ALK、ALK和stat3/survivin信號通路中p-stat3、stat3和survivin各蛋白表達(dá)量及活化水平的變化;對H2228親本細(xì)胞和H2228耐

3、藥細(xì)胞進(jìn)行基因測序。
　　結(jié)果:克唑替尼以時間依賴性方式抑制H2228細(xì)胞的增殖?？诉蛱婺嶙饔肏2228親本細(xì)胞和H2228耐藥細(xì)胞72小時的IC50值分別為334.5nmol/L和3418nmol/L。H2228耐藥細(xì)胞的耐藥指數(shù)為10.20。克唑替尼對H2228細(xì)胞有促凋亡作用(P＜0.05），且能使H2228細(xì)胞中的融合蛋白EML4-ALK V3的活化形式p-ALK明顯受到抑制，其下游的p-stat3及存活蛋白survivi

4、n的表達(dá)呈下降趨勢，但克唑替尼對H2228耐藥細(xì)胞株不具有促凋亡作用，且不能使p-ALK的表達(dá)受到抑制，下游通路stat3的活化水平及存活蛋白survivin的表達(dá)無下降趨勢。對應(yīng)EML4-ALK V3b2067、2182這2個位置的G、G堿基分別突變?yōu)锳、C堿基。
　　結(jié)論:克唑替尼以時間依賴的方式抑制人肺腺癌細(xì)胞株H2228的增殖?？诉蛱婺嵴T導(dǎo)的H2228細(xì)胞凋亡可能與stat3/survivin通路有關(guān)，并能下調(diào)p-ALK、