EML4-ALK融合型非小細胞肺癌特性的生物信息學分析及下游STAT3基因的功能驗證.pdf

1、研究背景:
　　 作為當前全世界發(fā)生率及死亡率最高的惡性腫瘤，肺癌具有很強的異質(zhì)性。根據(jù)幾十年來沿用的組織學分類方法指導下的肺癌治療，目前已遭遇重大瓶頸，而基于生物學特性的肺癌分類，仍是當前選擇治療策略的基礎(chǔ)。根據(jù)非小細胞(nonsmallcelllungcancer，NSCLC)患者表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是否存在敏感突變來選擇治療方案，這種量體裁衣的策略為靶向治

2、療目標人群帶來了突破性的生存獲益，已成為NSCLC基于分子分型個體化治療的典范。然而，NSCLC患者中分子驅(qū)動事件未知的仍占據(jù)相當份額，為了這部分患者也能得到最適宜的個體化治療，需要更詳細的NSCLC分子分型。
　　 2007年，間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase，ALK)基因和棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4(echinodermmicrotubuleassociatedproteinlike4，EML

3、4)融合型肺癌的發(fā)現(xiàn)，堪稱NSCLC臨床研究史上的又一里程碑事件。研究提示，該分子亞型的肺癌患者約占所有患者的5％;同時將EML4-ALK轉(zhuǎn)染入正常細胞后，該細胞可轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞，進入體內(nèi)后將最終定位于肺部形成腫瘤;體內(nèi)實驗證實，表達EML4-ALK融合基因的NSCLC腫瘤細胞在應用針對ALK的特異性小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinasesinhibitors，TKIs)Crizotinib后，腫瘤可顯著縮小乃至消失;早期

4、臨床試驗亦顯示，ALK融合型肺癌患者在給予ALKTKI后，其生存獲益較標準治療有顯著提高。目前美國食品藥品監(jiān)督管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)已批準將ALKTKI應用于發(fā)生ALK融合的晚期NSCLC患者。因此，EML4-ALK已成為繼EGFR之后NSCLC的一個新治療靶標。本研究所就收治的連續(xù)NSCLC病例進行了流行病學的初步研究，發(fā)現(xiàn)EML4-ALK在未經(jīng)選擇的國人患者中，發(fā)生率高于已報道的歐美日等

5、發(fā)達國家和地區(qū);且多發(fā)生于腺癌患者中。在與EGFR,K-RAS突變等常見肺癌分子事件間的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，EML4-ALK與上述兩者基本呈互斥性。目前，ALK作為受體酪氨酸激酶之一，其下游調(diào)控細胞惡性轉(zhuǎn)化生長的分子機制和相關(guān)關(guān)鍵信號通路尚不清楚，需要依靠流行病學數(shù)據(jù)提供的概率和趨勢，應用高通量的生物信息學手段，從海量數(shù)據(jù)中總結(jié)其獨特之處，并根據(jù)計算結(jié)果對關(guān)鍵分子進行后續(xù)的功能驗證。因此本研究分成二個部分:
　　 第一部分:采用生物

6、信息學領(lǐng)域相關(guān)工具，全面分析發(fā)生EML4-ALK基因融合的NSCLC在腫瘤信號轉(zhuǎn)導中各信號通路的變化狀態(tài)，并與發(fā)生其他分子事件的肺癌組織進行比較，篩選差異表達基因，對其進行注釋及歸類，在整體水平初步探索EML4-ALK融合型NSCLC的發(fā)病機制、特異性的生物學行為及信號轉(zhuǎn)導特征。
　　 第二部分:主要對第一部分的發(fā)現(xiàn)進行初步的功能驗證。通過對表達譜芯片的數(shù)據(jù)挖掘，我們發(fā)現(xiàn)STAT3參與的諸多腫瘤生物學過程和信號轉(zhuǎn)導通路在EML4

7、-ALK融合型肺癌的信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，該基因在多條重要通路中處于樞紐位置。為初步驗證STAT3的功能，我們通過RNAi技術(shù)在出現(xiàn)EML4-ALK融合及對照細胞系中沉默STAT3的表達，并通過構(gòu)建STAT3表達載體，利用分子克隆技術(shù)，將其在靶細胞中過表達，嘗試從正反兩個方面論證STAT3主導的信號轉(zhuǎn)導過程中，該分子表達水平的高低對通路各關(guān)鍵節(jié)點的影響，并初步分析該基因與腫瘤細胞增殖、凋亡間的相互作用，為后續(xù)的臨床研究及個體化治療

8、提供理論支持。
　　 課題設(shè)計與主要結(jié)果
　　 第一部分:EML4-ALK融合型肺癌生物學特性的數(shù)據(jù)挖掘與分析
　　 第一章:ALK表達水平與EML4-ALK融合發(fā)生的關(guān)系
　　 目的:
　　 分析NSCLC組織中EML4和ALK基因表達水平與EML4-ALK融合型肺癌發(fā)生的相關(guān)性。
　　 材料與方法:
　　 將本研究所流行病學研究的標本中質(zhì)控合格的94例NSCLC組織標本制備表達

9、譜芯片，采取customCDF的注釋方法及RMA(Robustmultiarrayanalysis)算法計算芯片雜交信號值。方差分析比較EML4-ALK融合組、非融合組和正常組織EML4、ALK兩個基因的表達水平;Pearson相關(guān)分析比較兩者間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:
　　 customCDF注釋方法共注釋18123個人類基因。含EML4-ALK融合組11例及非EML4-ALK融合組83例，應用RMA算法計算ALK基因

10、表達信號值并對數(shù)均一化后，EML4-ALK融合組腫瘤標本均值±SD為5.27±1.35，非EML4-ALK融合組腫瘤組織為2.99±0.17，正常組織中為2.86±0.16，EMLA-ALK融合高于非融合組(P=0.001)，高于正常組織(P=0.000)，差異有統(tǒng)計學意義，非融合組高于正常組織(P=0.000)，差異有統(tǒng)計學意義;EML4基因表達水平在融合組腫瘤組織、非融合組腫瘤組織和正常組織中表達水平分別為6.47±0.29、6.8

11、7±0.48和6.42±0.47，融合組與非融合組EML4表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)，非融合組與正常組EML4表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，融合組與正常組EML4表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.922)。Pearson相關(guān)分析融合組與非融合組EML4或ALK表達的相關(guān)性:EML4表達水平與融合基因狀態(tài)相關(guān)(P=0.009)，但R=-0.268，僅有弱相關(guān)性，實際效用很低;ALK表達與融合基因狀態(tài)相關(guān)(P=0.000)

12、，R=0.844，具有強相關(guān)性。
　　 結(jié)論:
　　 ALK基因高水平的表達和EML4-ALK融合顯著相關(guān)。
　　 第二章:EML4-ALK融合型與野生型NSCLC差異表達基因的篩選及功能注釋
　　 目的:
　　 根據(jù)NSCLC分子分型，篩選EML4-ALK融合型NSCLC標本和無ALK、K-RAS、EGFR等分子事件的標本（本文稱為野生型NSCLC，下同）間差異表達基因，基因本體(geneont

13、ology,GO)的注釋分析，總結(jié)出有差異的基因功能集，并從中篩選出與腫瘤發(fā)生、進展密切相關(guān)的信號通路，作為后續(xù)功能驗證的基礎(chǔ)。試圖闡述兩個方面問題:一是基因表達模式是如何在EML4-ALK融合型NSCLC中發(fā)生變化的;二是差異表達基因參與的代謝途徑有哪些以及這些代謝途徑在EML4-ALK融合型NSCLC發(fā)生過程中的可能作用。
　　 材料與方法:
　　 綜合數(shù)據(jù)挖掘工具BRB-ArrayTools(v4.1)、DAVID

14、(DatabaseforAnnotation,Visualization,andIntegratedDiscovery,v6.7)、GSEA(GeneSetEnrichmentAnalysis,v3.7)，分別對ALK融合型NSCLC和非ALK融合型NSCLC表達譜芯片數(shù)據(jù)集進行數(shù)據(jù)挖掘，參考數(shù)據(jù)庫為GO、KEGG等，并應用文獻自主挖掘系統(tǒng)對pubmed上可檢索到的文獻（僅針對摘要內(nèi)容）進行了初步的挖掘與篩選，以尋找組間差異表達基因，并

15、對其生物學行為過程、分子生物功能、信號轉(zhuǎn)導通路等領(lǐng)域進行了基因集富集和聚類分析。
　　 結(jié)果:
　　 EML4-ALK融合型與野生型NSCLC相比存在83個差異表達基因，其中30個基因出現(xiàn)表達水平的顯著上調(diào);53個基因出現(xiàn)顯著下調(diào)。這些差異表達基因經(jīng)注釋和富集分析，涉及5個生物學過程和4條信號轉(zhuǎn)導通路。
　　 結(jié)論:
　　 差異表達基因間具有一定的“相關(guān)性”，很少出現(xiàn)單個或是幾個基因參與某個生物過程。EM

16、L4-ALK融合型肺癌形成并非某個分子的生物學行為，上述這些基因功能和信號轉(zhuǎn)導通路的變化相互交錯、互相影響，最終構(gòu)成了EML4-ALK融合型NSCLC區(qū)別其他肺癌的分子基礎(chǔ)。
　　 第二部分:EML4-ALK信號通路關(guān)鍵基因STAT3的初步功能驗證
　　 第一章:STAT3表達產(chǎn)物的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
　　 目的:
　　 將與STAT3基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，以此為依托探索其中的核心

17、蛋白STAT3在EML4-ALK融合型肺癌中的作用。以期從蛋白質(zhì)相互作用水平闡述STAT3的異常與該型肺癌的聯(lián)系。
　　 材料與方法:
　　 以EML4-ALK融合型肺癌和野生型肺癌差異表達基因為基礎(chǔ)，應用cytoscape(v2.8)軟件系統(tǒng)構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫SWISS-PORT、HPRD中檢索相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用并結(jié)合文獻數(shù)據(jù)挖掘構(gòu)建與STAT3基因產(chǎn)物相互作用的網(wǎng)絡(luò)，對STAT3在肺癌參與的信號通

18、路進行富集分析，并與EML4-ALK出現(xiàn)異常的生物學行為和信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)進行比對。
　　 結(jié)果:
　　 以肺癌中與STAT3存在相互作用的蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-proteininteraction，PPI)。發(fā)現(xiàn)113個蛋白與STAT3相互作用，涉及至少23條與肺癌顯著相關(guān)的生物學過程、分子功能及信號轉(zhuǎn)導通路;將其進行功能聚類后與EML4-ALK融合型肺癌中出現(xiàn)異常表達的基因集求交集（與非A

19、LK融合型非小細胞肺癌比較，ALK融合型肺癌存在83個異常表達基因。見第一部分第二章結(jié)果部分），發(fā)現(xiàn)STAT3調(diào)節(jié)的ALK、GHR兩個分子在EML4-ALK型肺癌中異常表達;STAT3參與調(diào)節(jié)的Wnt通路在EML4-ALK融合型肺癌中也表達失調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 STAT3通過與ALK的直接相互作用，可能參與EML4-ALK融合型肺癌的發(fā)生與增殖;該基因調(diào)節(jié)的Wnt等信號通路在EML4-ALK融合型肺癌中亦存在異常。

20、這些發(fā)現(xiàn)揭示了STAT3在EML4-ALK融合型肺癌中的重要作用，有必要對STAT3基因的功能在EML4-ALK融合型肺癌中的作用進行進一步驗證。
　　 第二章:模式細胞中STAT3的表達對其生物學特性的影響
　　 目的;
　　 根據(jù)生物信息學分析，STAT3在EML4-ALK融合型肺癌中發(fā)揮了重要的信號轉(zhuǎn)導功能。本研究應用表達載體介導的RNAi技術(shù)及分子克隆技術(shù)，構(gòu)建STAT3干擾或過表達載體并通過在模式細胞中

21、控制該基因表達，探索EML4-ALK融合型肺癌中沉默或上調(diào)STAT3信號通路后腫瘤細胞生物學行為的改變。
　　 方法:
　　 細胞培養(yǎng):復蘇表達EML4-ALK融合基因的人肺腺癌H2228及EGFR/K-RAS野生型肺腺癌細胞株H1299，并用含10％胎牛血清的RPMI1640傳代培養(yǎng)。
　　 確定shRNA-STAT3序列:根據(jù)Genebank中檢索到人STAT3全長開發(fā)讀碼框(openreadingframe

22、，ORF)，調(diào)取3條不同的RNAiConsortium數(shù)據(jù)庫中經(jīng)商業(yè)驗證的shRNA-STAT3序列，并進行BLAST驗證比對。
　　 重組載體pSilencer4.1_CMV_STAT3的構(gòu)建與鑒定:以這三條驗證有效的siRNA干擾序列為基礎(chǔ)，遵從Ambion公司提供的pSilencer4.1_CMV載體構(gòu)建說明，將其設(shè)計為特異性的shRNA-STAT3單鏈模板。將合成的3對單鏈寡核苷酸經(jīng)HPLC純化、等比例混合退火后，與經(jīng)B

23、amHI和HindⅢ雙酶切線性化的pSilencer4.1_CMV按說明書建議比例以T4DNA連接酶16℃過夜連接;環(huán)化成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5(α);以Amp篩選陽性克隆并挑取之，然后過夜搖菌擴增;小提質(zhì)粒雙向測序鑒定;中提并純化成功構(gòu)建的干擾質(zhì)粒pSilencer4.1_CMV_STAT3，分裝備用。
　　 克隆STAT3基因:根據(jù)Genebank中檢索到人STAT3基因最長轉(zhuǎn)錄本的開發(fā)讀碼框(openreadingframe，

24、ORF)，設(shè)計帶有酶切位點的引物，以H2228細胞總cDNA為模板進行擴增
　　 重組質(zhì)粒pcDNA3.1+STAT3的構(gòu)建及鑒定:將模板擴增PCR產(chǎn)物純化后與克隆載體pMD-18T連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)、篩選陽性克隆并擴增;抽提質(zhì)粒行雙向測序等鑒定。中提并純化重組質(zhì)粒，分裝保存等步驟獲取重組載體pcDNA3.1+STAT3。
　　 瞬時轉(zhuǎn)染:應用RocheFugene6轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將重組質(zhì)粒和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肺腺癌細胞株H222

25、8和H1299。
　　 基因沉默效果檢測:RealTimeqPCR及WesternBlotting檢測各組細胞中STAT3及其他肺癌中的關(guān)鍵通路蛋白表達狀態(tài)。
　　 基因沉默后生物學特性改變:流式細胞儀AnnexinV/PI雙標記法檢測細胞的凋亡指數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 STAT3基因特異性沉默效果檢測:用WesternBlotting檢測shRNA-STAT3-1和shRNA-STAT3-2干擾效果，

26、具體分為5組:shRNA-STAT3-1、shRNA-STAT3-2、shRNA-scrambled、vector和空白。在模式細胞株H2228中，STAT3蛋白表達下調(diào)分別為64±2.3％和52±3.7％，ERK1/2和AKT及相應的磷酸化程度無明顯變化，mTOR出現(xiàn)了表達下調(diào)，其磷酸化水平呈顯著降低;在模式細胞H1299中，shRNA-STAT3-1、shRNA-STAT3-2分別使其STAT3表達下調(diào)65±3.1％和55±4.2％

27、，ERK1/2，AKT,mTOR及對應的磷酸化蛋白無顯著變化。scrambled、vector和Fugene6三個對照組未造成STAT3表達水平在各細胞系的顯著變化。
　　 生物學特性的變化:干擾48小時后，AnnexinV/PI雙標記法檢測發(fā)現(xiàn)H2228組右下象限凋亡早期細胞比例增高;H1299無顯著變化。
　　 STAT3基因過表達效果檢測:用RealTimeqPCR檢測pcDNA3.1+STAT3轉(zhuǎn)染H2228后的

28、表達水平，具體分為3組:pcDNA3.1+STAT3、vector和空白。在模式細胞株H2228中，STAT3基因表達水平顯著上調(diào);應用WesternBlotting檢測蛋白表達發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1+STAT3組蛋白表達顯著升高，提示STAT3過表達模型構(gòu)建成功。ERK1/2和AKT及相應的磷酸化程度無明顯變化，mTOR出現(xiàn)了表達上調(diào)，其磷酸化水平呈顯著升高。
　　 結(jié)論:
　　 成功構(gòu)建基于表達載體的STAT3干擾系統(tǒng)

29、;發(fā)現(xiàn)不表達EML4-ALK的腺癌細胞在STAT3表達沉默60％以上時未出現(xiàn)明顯的生物學STAT3變;而表達該融合基因的肺腺癌細胞則出現(xiàn)凋亡率的顯著增加。分析與STAT3相互作用的關(guān)鍵信號通路蛋白的變化狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，H1299中各通路蛋白未見明顯改變;H2228中mTOR的蛋白表達水平輕微下調(diào)，磷酸化水平顯著降低。
　　 成功構(gòu)建基于表達載體的STAT3過表達系統(tǒng);分析與STAT3相互作用的關(guān)鍵信號通路蛋白的變化狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，模式細胞中