旁路信號通路激活介導(dǎo)的EML4-ALK融合基因陽性肺癌細(xì)胞株H3122對alectinib繼發(fā)耐藥研究.pdf

1、目的:間變性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制劑(anaplastic lymphoma kinasetyrosine kinase inhibitor，ALK-TKI)的耐藥已成為其臨床應(yīng)用最普遍也是最大的障礙，旁路信號通路的激活是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)靶向治療的耐藥機(jī)制之一。本研究旨在探討肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、表皮生長因子(epid

2、ermal growth factor,EGF)及轉(zhuǎn)化生長因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）以旁路信號激活的方式誘導(dǎo)棘皮動(dòng)物微管結(jié)合蛋白樣蛋白4-間變性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein-like4-anaplastic lymphomakinase，EML4-ALK)融合基因陽性肺癌細(xì)胞株H3122對alectinib的耐藥，并進(jìn)

3、一步探討旁路信號激活在alectinib耐藥中的作用。
　　方法:1.ALK陽性肺癌細(xì)胞H3122對alectinib的敏感性檢測檢測ALK陽性肺癌細(xì)胞H3122對alectinib的敏感性，H3122細(xì)胞含EML4-ALK融合基因變體1。根據(jù)CCK-8使用說明書，檢測H3122細(xì)胞在不同濃度的alectinib處理下，細(xì)胞的增殖情況。HGF、EGF、TGF-α誘導(dǎo)后ALK陽性肺癌細(xì)胞H3122對alectinib的敏感性的檢測，

4、應(yīng)用HGF(50ng/mL)、EGF(100 ng/mL)、TGF-α（100 ng/mL）聯(lián)合不同濃度的alectinib處理H3122細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72h后，檢測在有HGF、EGF、TGF-α存在的情況下ALK陽性肺癌細(xì)胞H3122細(xì)胞對alectinib敏感性變化。
　　2.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測H3122細(xì)胞在0.05μ mol/Lalectinib作用48h的凋亡率，檢測HGF（50 ng/mL）、EGF（100 ng/mL

5、）、TGF-α（100 ng/mL）誘導(dǎo)后alectinib對H3122細(xì)胞的凋亡率。
　　3.應(yīng)用免疫印跡(Western blot)技術(shù)檢測alectinib單獨(dú)或聯(lián)合HGF(50ng/mL)、EGF(100 ng/mL)、TGF-α(100 ng/mL)處理后H3122細(xì)胞中ALK、MET、EGFR及磷酸化蛋白的表達(dá)，并觀察其下游信號通路關(guān)鍵蛋白AKT、ERK、p-AKT、p-ERK水平，探討分子機(jī)制。
　　結(jié)果:1.

6、ALK陽性肺癌細(xì)胞H3122對alectinib高度敏感Alectinib作用72h后，H3122的活性隨著alectinib藥物濃度的增加而逐漸下降，呈濃度依賴性，alectinib對H3122的IC50為0.042μ mol/L。
　　2.在外源性HGF、EGF、TGF-α的暴露下，H3122細(xì)胞對alectinib的敏感性顯著下降，HGF、EGF、TGF-α誘導(dǎo)后alectinib抑制H3122細(xì)胞的生長曲線往右移，HGF、

7、EGF、TGF-α處理能夠緩解alectinib對H3122細(xì)胞活性的抑制作用。
　　3.Alectinib對H3122細(xì)胞有促凋亡作用（P＜0.05），0.05μ mol/L的alectinib作用H3122細(xì)胞株48h后的凋亡率為(20.12±1.36)％，而alectinib聯(lián)合HGF、EGF、TGF-α后的凋亡率分別為(7.85±1.03)％、(5.6±0.79)％、(4.58±1.00)％，顯著低于aleetinib單藥

8、處理(P＜0.05)。
　　4.蛋白檢測提示H3122細(xì)胞可測得ALK和下游信號通路蛋白AKT、ERK及其磷酸化蛋白，0.05μ mol/L alectinib單藥作用2h后成功抑制ALK及其下游信號蛋白AKT、ERK的磷酸化。聯(lián)合50 ng/mL HGF、100 ng/mLEGF、100 ng/mL TGF-α后H3122細(xì)胞中的p-ALK被抑制，但仍然表達(dá)p-AKT、p-ERK，50 ng/mL HGF處理后明顯增加細(xì)胞中p-