水蛭提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凝血相關(guān)因子以及對(duì)內(nèi)皮功能紊亂相關(guān)分子的影響.pdf

1、心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVDs)是目前全球致死率最高的疾病，很快就會(huì)成為全球主要的健康問題。動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種進(jìn)行性疾病，其主要特征是脂質(zhì)和纖維類物質(zhì)在大動(dòng)脈中不斷積累，它是造成心血管疾病日益增長(zhǎng)的重要原因。
　　水蛭是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，它具有破血、逐淤等功能，其煎劑、口服液等劑型廣泛用于心血管疾病的防治。但是其不良反應(yīng)也時(shí)有發(fā)生，其中出血不良反應(yīng)最為突

2、出，嚴(yán)重影響患者的健康。在前期對(duì)水蛭活性成分研究的基礎(chǔ)上，我們推測(cè)可能是水蛭中的某些成分對(duì)機(jī)體的凝血因子產(chǎn)生了影響，使其凝血活性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致了出血不良反應(yīng)。而內(nèi)皮細(xì)胞在機(jī)體凝血中有重要的作用。所以本論文以水蛭的干燥全體為原材料，采用不同的提取條件和轉(zhuǎn)化條件，以期能獲得一種既不影響內(nèi)皮細(xì)胞中凝血相關(guān)因子mRNA的表達(dá)，又能夠抑制AS發(fā)展的水蛭制備方法，從而找到一種臨床可長(zhǎng)期用于AS的預(yù)防，安全可靠的，出血不良反應(yīng)弱的新型口服制劑。<

3、br>　　具體的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.不同條件下水蛭提取物的制備
　　本實(shí)驗(yàn)以水蛭的干燥全體為原材料，分別用水提、胃蛋白酶酶解、胃蛋白酶和胰蛋白酶聯(lián)用雙酶解和粗酶酶解四種制備方法得到4種水蛭提取物，分別命名為水蛭粉水提物(LP)、胃蛋白酶酶解水蛭提取物(PHL)、胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解的水蛭提取物(PTHL)和粗酶酶解的水蛭提取物(CEHL)。另外將得到的PHL和PTHL的水蛭提取物進(jìn)行乳酸桿菌的代謝轉(zhuǎn)化，得到了乳酸

4、桿菌在MRS培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物(MRS)、乳酸桿菌在不含氮源的MRS培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物（MRS-1）以及乳酸桿菌在PHL作為氮源的MRS培養(yǎng)基中的代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(MRS-2)和乳酸桿菌在PTHL作為氮源的MRS培養(yǎng)基中的代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(MRS-3)4種提取物，共制備了8個(gè)樣品。
　　2.不同水蛭提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凝血活性的影響
　　將提取得到的8個(gè)水蛭提取物作用于EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞，利用RT-PCR對(duì)EA.hy926細(xì)胞凝血

5、相關(guān)因子，包括促凝血因子PAI、vWF和抗凝血因子tPA、PS、TFPI、TM mRNA的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0-50μg/ml的濃度范圍內(nèi)，LP可以顯著促進(jìn)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞凝血相關(guān)因子mRNA的表達(dá);PHL和MRS-1對(duì)EA.hy926細(xì)胞凝血相關(guān)因子mRNA的表達(dá)均無(wú)影響;PTHL可以顯著降低EA.hy926細(xì)胞凝血相關(guān)因子mRNA的表達(dá);CEHL可以促進(jìn)PAI和PS mRNA的表達(dá)，但是對(duì)vWF、tPA、TFPI、T

6、M的mRNA的表達(dá)均有一定的抑制作用;MRS可以促進(jìn)EA.hy926細(xì)胞中PAI、vWF、tPA、TM mRNA的表達(dá)，而對(duì)PS和TFPI mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響;MRS-3可以促進(jìn)EA.hy926細(xì)胞中PAI、vWF、tPA、PS、TM mRNA的表達(dá)，而對(duì)TFPI mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響。上述結(jié)果中只有PHL和MRS-1對(duì)EA.hy926細(xì)胞中凝血相關(guān)因子mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響，MRS-1為對(duì)照組，所以接下來(lái)對(duì)PHL對(duì)內(nèi)皮功能

7、紊亂的影響進(jìn)行探究。
　　3.胃蛋白酶酶解水蛭提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的保護(hù)作用。
　　我們首先以10 ng/mL TNF-α刺激EA.hy926細(xì)胞12h建立內(nèi)皮功能紊亂的模型，經(jīng)過(guò)TNF-α刺激后的EA.hy926細(xì)胞內(nèi)ET-1、iNOS、MCP-1和IL-6 mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組相比均有明顯升高(＃p＜0.05)，而50μg/ml的PHL可以顯著抑制由TNF-α誘導(dǎo)的ET-1、iNOS、MCP-1和IL-6 mRN

8、A的表達(dá)量的升高（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。說(shuō)明PHL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂具有一定的保護(hù)作用。
　　綜上所述，經(jīng)過(guò)胃蛋白酶酶解的水蛭提取物PHL對(duì)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞中凝血相關(guān)因子PAI、vWF、tPA、PS、TFPI和TM mRNA的表達(dá)均無(wú)明顯影響，而且在50μg/ml濃度下對(duì)由TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能紊亂具有一定的保護(hù)作用。它為臨床上可長(zhǎng)期用于動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防，出血不良反應(yīng)弱的新型口服制劑