苦蕎蛋白的制備、生物活性鑒定及其在豬群中的應(yīng)用.pdf

1、蕎麥?zhǔn)且环N糧藥兼用的農(nóng)作物，富含多種營養(yǎng)成分，包括蛋白質(zhì)、膳食纖維、黃酮類物質(zhì)以及礦物元素等?？嗍w蛋白的氨基酸組成比較特別，其營養(yǎng)價(jià)值高于大豆、小麥、玉米等作物。已有研究發(fā)現(xiàn)蕎麥蛋白或多肽具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降膽固醇等多種生理活性，因此在飼料添加劑方面有廣闊的應(yīng)用前景。本研究成功提取了苦蕎蛋白，并對其體內(nèi)、外生物活性和功能進(jìn)行了探討，研究包括以下4個(gè)方面:
　　1.苦蕎蛋白的提取與分離純化
　　采用硫酸銨鹽析法提取得到

2、苦蕎蛋白粗提物，然后分別采用DEAE-Sepharose離子交換和Sephadex G-75凝膠過濾層析對苦蕎蛋白粗提物進(jìn)行分離純化，SDS-PAGE法分別測定了苦蕎蛋白粗提物和分離峰的分子量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦蕎蛋白粗提物中的蛋白分子量大小主要介于11KDa-60KDa之間，而活性峰的分子量為38KDa，將其命名為苦蕎鹽溶性球蛋白(WSBWP)。
　　2.苦蕎鹽溶性球蛋白(WSBWP)的結(jié)構(gòu)特征研究分別采用Edman測序法和MALDI-

3、TOF質(zhì)譜法分析了苦蕎鹽溶性球蛋白(WSBWP)的一級結(jié)構(gòu)，根據(jù)測序結(jié)果和Mascot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)前體共由393個(gè)氨基酸殘基組成，其中信號肽由22個(gè)氨基酸殘基組成，成熟肽由371個(gè)氨基酸殘基組成。該序列與苦蕎種子貯存蛋白13S球蛋白的α亞基的N末端氨基酸序列完全一致，說明WSBWP很可能就是苦蕎種子貯存蛋白13S球蛋白的酸性亞基。以籽粒莧種子貯存蛋白中的11S球蛋白為模板（同源性為43.65％）,在SWISS-MOD

4、EL工作平臺(tái)上進(jìn)行同源建模，構(gòu)建了WSBWP的三維模型，與大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)相似，因此WSBWP屬于大豆11S球蛋白超家族的一員。
　　3.苦蕎鹽溶性球蛋白(WSBWP)及其活性肽的體外活性研究
　　采用體外研究方法分別檢測了苦蕎鹽溶性球蛋白和其酶解活性肽(Pep-1-4)的抗菌活性、膽酸鹽吸附活性、自由基清除能力和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性。抗菌活性檢測發(fā)現(xiàn)樣品對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用;體外膽酸鹽吸附活性研究表明

5、WSBWP、多肽Pep-1和Pep-3對膽酸鈉、牛磺膽酸鈉和脫氧膽酸鈉三種膽酸鹽都有一定的吸附能力，而WSBWP的膽酸鹽吸附能力不如多肽強(qiáng);抗氧化活性研究檢測了樣品自由基(OH·)的清除能力，發(fā)現(xiàn)WSBWP、多肽Pep-1和Pep-3對OH·都有一定的清除能力;MTT法分別檢測了苦養(yǎng)活性肽對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人胃癌MGC80-3細(xì)胞和人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞的增殖抑制活性，結(jié)果該活性肽對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用比較明顯，其抑制

6、效果強(qiáng)于對MGC80-3細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞的抑制作用。
　　4.苦蕎蛋白在豬群中的應(yīng)用研究初探
　　1)苦蕎蛋白在斷奶仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用研究初探
　　在斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧中添加苦蕎蛋白后，發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬平均日增重比對照組增加了36.84％，料重比下降了33.33％，腹瀉率下降了41.6％，說明食用苦蕎蛋白提高了斷奶仔豬的生長性能和抗病力。血液生化分析發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組仔豬血液中的總膽固醇(TC)水平降低了16.75％，而甘油三酯

7、(TG)水平降低了39.73％，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平明顯增加，而且HDL-C與LDL-C的比率增加了32.94％;仔豬血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)水平比對照組高出32.64％，而谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)水平比對照組高出28.07％，堿性磷酸酶(AKP)水平比對照組略有升高。通過測胃液pH發(fā)現(xiàn)苦蕎蛋白組的仔豬胃液pH由4.28降至3.69。同時(shí)，苦蕎蛋白組的仔豬胃的相對重量比對照組增加了20.44％，肝臟相對重量比對照組減少了

8、19.31％。通過Miseq高通量測序得到了斷奶仔豬糞便樣品的微生物組成多樣性，在門水平分析發(fā)現(xiàn)樣品中的優(yōu)勢菌主要是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)。在屬水平分析發(fā)現(xiàn)，仔豬食用苦蕎蛋白后，腸道中的乳酸菌(Lactobacillus)、瘤胃菌(Ruminococcus)和經(jīng)粘液真桿菌(Blautia)的含量明顯增加;但一些致病菌如普雷沃菌(Prevotella

9、)、鏈球菌(Streptococcus)的含量明顯下降。結(jié)果認(rèn)為，飼料中給仔豬添加苦蕎蛋白后可提高斷奶仔豬平均日增重、降低料重比，且可改善胃酸分泌，明顯降低腹瀉率。此外，實(shí)驗(yàn)組仔豬的膽固醇、甘油三酯等血液生化指標(biāo)優(yōu)于對照組，腸道菌群組成也發(fā)生了明顯的改善。
　　2)苦蕎蛋白在育肥豬生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用
　　苦蕎蛋白在斷奶仔豬取得較好的試驗(yàn)效果后，采用80頭體重在80-90 kg的長白豬、大白豬和太湖黑豬（長×大×太）三元雜交的育

10、肥豬為研究對象進(jìn)行了推廣試驗(yàn)。試驗(yàn)過程將育肥豬隨機(jī)分兩組，對照組和實(shí)驗(yàn)組各40頭豬，試驗(yàn)組日糧中添加5％蕎麥蛋白，對照組添加等量的大豆蛋白，飼喂時(shí)間持續(xù)一個(gè)月，每天觀察豬只生長狀態(tài)并記錄。試驗(yàn)開始和試驗(yàn)結(jié)束前分別將育肥豬空腹12小時(shí)，逐頭稱體重。平時(shí)記錄采食量并結(jié)算飼料消耗情況，計(jì)算平均日增重(ADG)、料重比(F/G)以及出欄率。在育肥豬的推廣實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)組育肥豬的平均日增重比對照組增加了22.22％，與對照組相比料重比下降了14.