虎紋蛙病毒囊膜蛋白001L、020R的篩選、鑒定及功能初步研究.pdf

1、虎紋蛙病毒(Tigerfrogvirus，TFV)屬于虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒屬(Ranavirus)，其全基因組序列在2002年完成測(cè)定。為了更好的研究病毒的結(jié)構(gòu)以及病毒在感染過(guò)程、與宿主相互作用中涉及到的關(guān)鍵基因，我們通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和生物信息學(xué)分析的方法，篩選出了四個(gè)候選基因，ORF001L、ORF019R、ORF020R和OEF053R，作為我們的研究對(duì)象。四個(gè)基因在蛙病毒屬里都比較保守，其中ORF0

2、01L和ORF020R生物信息學(xué)預(yù)測(cè)兩個(gè)基因均有跨膜區(qū)，可能編碼囊膜蛋白。為了鑒定這四個(gè)蛋白是否為病毒結(jié)構(gòu)蛋白，我們首先將四個(gè)基因進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)。因?yàn)镺RF019R表達(dá)困難，我們只對(duì)ORF001L、ORF020R、ORF053R制備了多克隆抗體。轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析(transcriptional analysis)表明這三個(gè)基因均為晚期基因，與純化病毒粒子的蛋白印跡(Western blot)顯示這三個(gè)蛋白可能為結(jié)構(gòu)蛋白。間接免疫熒光和

3、感染細(xì)胞的蛋白組分檢測(cè)表明ORF001L、ORF020R這兩個(gè)病毒蛋白主要分布在胞質(zhì)和待鑒定的膜結(jié)構(gòu)上，免疫電鏡的結(jié)果證實(shí)這兩個(gè)蛋白均為病毒囊膜蛋白，而OR053R明確定位需要進(jìn)一步鑒定。 為了進(jìn)一步研究病毒蛋白的功能，我們進(jìn)行了一系列的試驗(yàn)?？贵w中和試驗(yàn)顯示，ORF001L和ORF020R病毒蛋白的抗體都不能阻止病毒的感染，但是抗001L的抗體可以推遲上清病毒滴度高峰的出現(xiàn)。我們采用了RNA干擾(RNAi)技術(shù)對(duì)兩個(gè)囊膜蛋白在

4、病毒復(fù)制中的作用進(jìn)行初步探討。通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄(invitrotranscription)的方法，合成了針對(duì)ORF001L和ORF020R的特異性siRNA，并通過(guò)與pEGFP-001和pEGFP-020真核質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法驗(yàn)證siRNA的特異性和有效性。把siRNA轉(zhuǎn)染幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞，隨后進(jìn)行TFV感染。通過(guò)定期觀察細(xì)胞病理變化(cytopathogenic effect，CPE)的方法，直接檢測(cè)siRNA對(duì)病毒增殖的影響；應(yīng)用半

5、定量RT-PCR(Sq-RT-PCR)的方法進(jìn)行基因表達(dá)分析，檢測(cè)siRNA對(duì)基因表達(dá)水平的影響；同時(shí)應(yīng)用病毒滴度(TCID50)測(cè)定的方法，檢測(cè)新生的病毒量及其毒力。結(jié)果顯示，這兩個(gè)基因沉默以后對(duì)病毒的復(fù)制沒(méi)有明顯的影響，其在病毒侵染中的作用需要進(jìn)一步研究。為了檢測(cè)相互作用蛋白存在與否，我們使用pMAL-c2X表達(dá)載體獲得了可溶性的MBP-001和MBP-020。將可溶性蛋白與細(xì)胞孵育后，再使用間接免疫熒光檢測(cè)相互作用蛋白的存在。結(jié)果