虎紋蛙病毒(TFV)感染HepG2細(xì)胞侵染途徑的研究.pdf

1、世界各地有許多養(yǎng)殖魚類遭受虹彩病毒(Iridovirus)感染而造成經(jīng)濟(jì)上的損失。本文研究了虹彩病毒科蛙病毒屬的虎紋蛙病毒(TFV)入侵細(xì)胞初期的機(jī)制，有利于我們更加詳細(xì)的了解虹彩病毒的生活周期、感染途徑及其受體，為虹彩病毒的防治奠定理論基礎(chǔ)。
　　 本研究以虹彩病毒科蛙病毒屬的虎紋蛙病毒為題材。首先我們制備了TFV囊膜蛋白ORF020R的抗體，并鑒定了抗體的特異性.然后利用反轉(zhuǎn)錄PCR，間接免疫熒光(indirect immu

2、nofluorescence)和免疫印跡(western blotting)分別從核酸水平和蛋白水平證實(shí)了TFV能感染HepG2細(xì)胞。進(jìn)一步研究了TFV感染HepG2的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和感染動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)病毒與細(xì)胞結(jié)合以及感染細(xì)胞都需要約2h。根據(jù)肌動(dòng)蛋白抑制劑細(xì)胞分裂素B和動(dòng)力蛋白抑制劑dynasore能抑制病毒的感染的結(jié)果，我們推測(cè)出TFV感染HepG2細(xì)胞可能參與的兩條內(nèi)吞途徑：網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和胞膜窖(cave

3、olae)介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑。
　　 利用作用于內(nèi)體(endosome)的化合物NH4Cl、wortmanin和nocodazole處理細(xì)胞后，病毒感染量明顯減少，表明TFV成功感染HepG2細(xì)胞需要經(jīng)歷一個(gè)內(nèi)體酸化過程，這與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑后期相一致。但是利用抑制網(wǎng)格蛋白包被小窩在膜上的聚集的藥物CPZ處理細(xì)胞，以及網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞途徑中的重要蛋白Eps15的顯性失活載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，病毒感染細(xì)胞的量變化不大，表明病毒并非以網(wǎng)格蛋

4、白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞的，只是經(jīng)歷了一個(gè)內(nèi)體過程。
　　 為了進(jìn)一步研究病毒是以何種方式進(jìn)入到細(xì)胞中的，我們研究發(fā)現(xiàn)胞膜窖脫落促進(jìn)物Okadic acid對(duì)病毒感染具有促進(jìn)作用，表明病毒進(jìn)入細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷胞膜窖過程。而胞膜窖途徑需要膽固醇的參與，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果膽固醇剔除劑mβCD使病毒感染量明顯減少相一致.采用胞膜窖的主要組成蛋白caveolin-1的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑CSDP來抑制caveolin-1的功能，病毒感染量的減小揭示了

5、病毒感染是依賴于窖蛋白1的。進(jìn)一步，通過激光共聚焦顯微技術(shù)分析了TFV與CTxB共同內(nèi)化情況，兩者共定位的結(jié)果表明TFV是以胞膜窖途徑進(jìn)入細(xì)胞的。這些結(jié)果共同表明了TFV感染HepG2細(xì)胞是通過窖蛋白1依賴的胞膜窖途徑進(jìn)入細(xì)胞。
　　 綜述所述，病毒進(jìn)入細(xì)胞是依賴于胞膜窖形成的囊泡，而囊泡脫落后參與到了網(wǎng)格蛋白途徑下游的內(nèi)體環(huán)境中。據(jù)此我們推測(cè)TFV感染HepG2細(xì)胞是通過胞膜窖介導(dǎo)的病毒內(nèi)化途徑之后，胞膜窖囊泡被迅速轉(zhuǎn)移到內(nèi)體