血清藥理學(xué)方法研究復(fù)方黃黛片對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:通過(guò)更接近真實(shí)體內(nèi)給藥環(huán)境的血清藥理學(xué)方法證明復(fù)方黃黛片能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑治療慢性粒細(xì)胞白血病，為復(fù)方黃黛片拓展應(yīng)用新的適應(yīng)癥提供理論依據(jù)。
　　方法:清潔級(jí)SD大鼠為研究對(duì)象，復(fù)方黃黛片混懸劑連續(xù)灌胃7天，每天1次。腹主動(dòng)脈取血，電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS)檢測(cè)血清中砷濃度。血清藥物濃度以砷含量計(jì)。5μg/ml含藥血清作用于白血病K562細(xì)胞，24h后觀察細(xì)胞給藥前后形態(tài)學(xué)變化。運(yùn)用CCK-8方法檢測(cè)不同濃度

2、含藥血清(0μg/ml，2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml,60μg/ml)給藥后12h,24h,48h對(duì)白血病K562細(xì)胞的增殖抑制作用。Calcein-AM/PI熒光染色、AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)不同濃度含藥血清(0μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml)對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響;Western-Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase

3、-3、Cleaved Caspase-3、Caspase-9、Cleaved Caspase-9在不同濃度含藥血清（0μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml）作用后的含量表達(dá)情況。
　　結(jié)果:復(fù)方黃黛片含藥血清中含砷濃度為1.532μmol/l。給藥24h后，K562細(xì)胞邊緣模糊不清，細(xì)胞皺縮變小，中心出現(xiàn)破碎的物質(zhì)，數(shù)量明顯變少。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度含藥血清2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/

4、ml，20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml作用12h后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率分別為1.39％、3.43％、9.43％、15.72％、30.73％、50.34％;作用24h后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率分別為4.33％，1072％，36.24％，60.58％，71.73％，80.43％;作用48h后，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率分別為9.76％，14.11％，48.72％，81.04％，88.65％，89.67％。Calcein-AM/PI熒光染色觀察

5、可見，隨血清濃度增加，正常細(xì)胞數(shù)量明顯減少，死亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法測(cè)得不同給藥濃度為0μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml時(shí)，凋亡率分別為0.9％，11.6％，31.5％，64.3％。含藥血清組與對(duì)照組相比，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)均有改變，凋亡標(biāo)志性蛋白Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9及Bax表達(dá)增加，Bcl-2，Caspase-3，Caspas