利用全外顯子組測(cè)序技術(shù)尋找家族性噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥的潛在的“二次打擊”發(fā)病機(jī)制.pdf

1、第一部分成人家族性噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥2型患者家系調(diào)查及發(fā)病機(jī)制的探索
　　【目的】尋找具有同樣的穿孔素基因突變的同胞卻有不同的發(fā)病狀態(tài)（一個(gè)發(fā)病而另一個(gè)完全健康）的原因，探索該疾病其他可能的發(fā)病機(jī)制。
　　【方法】以成人家族性噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥2型（FHL2）患者及家屬為研究對(duì)象，搜集臨床資料，完善分子生物學(xué)、免疫學(xué)檢測(cè)及全外顯子組測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析尋找潛在的導(dǎo)致疾病發(fā)生的額外突變。

2、r>　　【結(jié)果】通過搜集臨床資料和檢測(cè)NK細(xì)胞活性、EBV-DNA、穿孔素、HLH二代測(cè)序等確診患者為FHL2，對(duì)患者父母、胞弟及兒子進(jìn)行穿孔素一代測(cè)序描繪出家系圖譜。FHL2患者及其無癥狀的弟弟均有PRF1雜合錯(cuò)義突變（c.916G>A）和雜合框移突變（c.65delC）。通過全外顯子組測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)FASTKD3, HOXA10和SVEP1基因雜合自發(fā)性體細(xì)胞突變僅存在于先證者中。對(duì)于生殖系突變，隱性疾病遺傳模式分析得出PCDH18

3、, CKD11B, MAGEC1,NOS1和PPP1R14BP3基因，顯性疾病遺傳模式分析得出MLL3, PCDH18, ANKRD36,HNRNPC, PCMTD1和MAGEC1基因；很明顯，PCDH18基因是兩種分析模式共有的基因，且僅有先證者PCDH18（c.3017C>T）基因突變?yōu)榧兒贤蛔?，其家屬均為雜合突變，而且Polyphen-2軟件預(yù)測(cè)該突變可能有害。
　　【結(jié)論】本研究是第一次應(yīng)用全外顯子組測(cè)序技術(shù)來探索導(dǎo)致FH

4、L2發(fā)病的潛在“二次打擊”機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的PRF1雜合突變組合（c.916G>A和c.65delC）。唯獨(dú)在先證者中發(fā)現(xiàn)純合的生殖系突變 PCDH18（c.3017C>T）強(qiáng)烈支持除穿孔素外存在“二次打擊”生殖系突變，可能是誘發(fā)FHL2發(fā)生的重要機(jī)制。
　　第二部分PCDH18（S1006L）突變?cè)贔HL2發(fā)生中的作用初探
　　【目的】初步探索針對(duì)FHL2家系的全外顯子組測(cè)序篩選出的PCDH18（S1006L）突變?cè)?/p>

5、FHL2發(fā)生中的可能機(jī)制。
　　【方法】通過PyMOL軟件預(yù)測(cè)PCDH18突變對(duì)蛋白三維結(jié)構(gòu)的影響，并計(jì)算突變前后吉布斯自由能的變化。構(gòu)建PCDH18野生型和突變型質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞及HepG2細(xì)胞來觀察突變對(duì)轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平的影響，轉(zhuǎn)染CTLL-2細(xì)胞并觀察突變對(duì)細(xì)胞活化和凋亡的影響。免疫組化檢測(cè)先證者標(biāo)本中PCDH18蛋白水平與其無癥狀的弟弟及正常對(duì)照的差異。
　　【結(jié)果】我們使用PyMOL軟件構(gòu)建出野生型和突變型（

6、S1006L）PCDH18蛋白三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)PCDH18突變導(dǎo)致氨基酸由絲氨酸置換為亮氨酸，由親水性氨基酸變?yōu)槭杷园被?，且氫鍵數(shù)目減少，突變域可能被強(qiáng)烈改變，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；該突變引起的吉布斯自由能改變（△△G）為8.08 kcal/mol(＞2 kcal/mol)，也提示該突變導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。將野生型、突變型（S1006L）和陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和HepG2細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的變化，結(jié)果提示轉(zhuǎn)錄水平變化不大，而突

7、變組PCDH18蛋白量明顯減低。為研究該突變對(duì)細(xì)胞功能的影響，我們將野生型、突變型（S1006L）和陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 CTLL-2細(xì)胞，結(jié)果提示過表達(dá)野生型質(zhì)粒對(duì)CTLL-2細(xì)胞的活化有抑制作用（無論是否加用 rIL-2），對(duì)細(xì)胞凋亡有增強(qiáng)作用，而突變型質(zhì)粒則會(huì)抵消掉活化抑制和凋亡增強(qiáng)的效應(yīng)。免疫組化結(jié)果提示先證者PCDH18的蛋白水平比其無癥狀的胞弟及正常對(duì)照組均要低。
　　【結(jié)論】通過功能學(xué)研究我們發(fā)現(xiàn)，S1006L突變能夠

8、引起蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，蛋白量減低，可能使細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞活化增強(qiáng)、凋亡受阻，協(xié)同穿孔素基因突變一起導(dǎo)致FHL2的發(fā)生。
　　第三部分遲發(fā)性FHL發(fā)病年齡與遺傳缺陷及EBV感染間相互關(guān)系的研究
　　【目的】：為研究遲發(fā)性FHL患者發(fā)病年齡與遺傳缺陷及EBV感染間的相關(guān)關(guān)系。
　　【方法】：搜集臨床懷疑 HLH的患者臨床資料，結(jié)合臨床經(jīng)過、HLH二代測(cè)序等結(jié)果識(shí)別出遲發(fā)性 FHL，并對(duì)其家系進(jìn)行調(diào)查，繪制家系圖譜，檢測(cè)

9、家系中各成員的EBV-DNA。采用R語言繪制發(fā)病年齡與遺傳缺陷及EBV感染間的相關(guān)關(guān)系圖。
　　【結(jié)果】：根據(jù)HLH患者臨床資料、HLH-2004方案治療療效、HLH二代測(cè)序結(jié)果鑒定出4例遲發(fā)性FHL，并對(duì)該4例FHL患者進(jìn)行家系調(diào)查，繪制出遺傳圖譜。采用R語言繪制出的發(fā)病年齡與遺傳缺陷及 EBV感染間相關(guān)關(guān)系圖顯示，具有相似遺傳缺陷的患者，EBV-DNA拷貝數(shù)越高則發(fā)病年齡越小，反之亦然；具有相似 EBV-DNA拷貝數(shù)的患者，遺