青春期至成年早期雙酚A暴露對(duì)小鼠行為的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、雙酚A(bisphcnol A,BPA)是酚類(lèi)化合物中具代表性的一類(lèi)環(huán)境雌激素污染物,多應(yīng)用于食品和飲料碳酸聚酯包裝材料、金屬罐頭樹(shù)脂內(nèi)膜、牙齒固封劑等。作為一種類(lèi)雌激素,BPA與雌激素受體具有一定的親和性,能模擬和干擾體內(nèi)雌激素的正常代謝和生理活動(dòng)。尤其是在組織形成和發(fā)育時(shí)期,對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重威脅。許多研究發(fā)現(xiàn)圍生期BPA暴露影響嚙齒類(lèi)腦和行為的發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn),圍生期BPA暴露影響子代小鼠的多種社會(huì)行為及其性別分化。青春

2、期是動(dòng)物機(jī)體發(fā)育的第二個(gè)高峰時(shí)期,其行為也受性激素的調(diào)節(jié),因此推測(cè)青春期BPA暴露也可能影響小鼠的非生殖行為。
　　 突觸可塑性包括突觸結(jié)構(gòu)修飾和突觸功能的可變性,容易受行為、環(huán)境和藥物的影響,與學(xué)習(xí)記憶等行為密切相關(guān)。PSD-95(post synaptic density protein 95)是突觸后致密體(PSD)上具有代表性的腳手架蛋白,可對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子進(jìn)行整合而調(diào)節(jié)突觸活動(dòng),谷氨酸NMDA受體是興奮性突觸的突觸后必需

3、組份,它們的表達(dá)均受內(nèi)源性雌激素影響。因此,本研究進(jìn)一步分析突觸結(jié)構(gòu)修飾、突觸蛋白和NMDA受體與青春期BPA暴露對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)、探究、焦慮以及學(xué)習(xí)記憶行為影響的關(guān)系,初步探索青春期BPA暴露對(duì)動(dòng)物行為影響的分子機(jī)制。
　　 方法:取體重18-23 g,4周齡清潔級(jí)ICR小鼠,適應(yīng)1周后,按性別隨機(jī)分為40、400 μg／kg／day BPA染毒組和對(duì)照組,每組10只；從第5周每天早8點(diǎn)灌胃染毒持續(xù)8周,然后進(jìn)行開(kāi)場(chǎng)、高架十字迷

4、宮、水迷宮和跳臺(tái)行為檢測(cè),分別檢測(cè)小鼠的自發(fā)活動(dòng)行為、探究行為、焦慮行為、空間學(xué)習(xí)記憶行為和被動(dòng)回避記憶行為。染毒至行為檢測(cè)結(jié)束(共9周半)。對(duì)照組等體積灌胃溶媒花生油。行為測(cè)試結(jié)束后,處死小鼠,按要求取海馬組織樣品,分別做超薄切片電鏡觀察海馬突觸界面參數(shù)、HE病理切片檢查CA1區(qū)形態(tài)變化、免疫組化技術(shù)檢測(cè)CA1區(qū)PSD-95蛋白表達(dá),western—blot技術(shù)檢測(cè)海馬NMDA受體NR1和NR2B亞基表達(dá)；同時(shí)檢測(cè)體重、血清雌激素或雄

5、激素水平。
　　 用Quantity one軟件測(cè)定蛋白條帶光密度值,用Image-Pro Plus 5.0分析測(cè)定免疫細(xì)胞化學(xué)圖片。最后實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS1.5.0統(tǒng)計(jì)軟件中的One-way ANOVA法分析,進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性。
　　 結(jié)果:1、40和400μg／kg／d劑量的BPA組的雄鼠和40μg／kg／d劑量BPA組的雌鼠體重均明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05),此外,同一BPA

6、處理組雄鼠體重均顯著高于雌鼠(P<0.01)；小鼠血清激素水平檢測(cè)表明,BPA對(duì)雌、雄小鼠血清雌激素、睪酮激素沒(méi)有影響。
　　 2、BPA暴露后,開(kāi)場(chǎng)行為結(jié)果顯示:BPA暴露不影響同性別小鼠在開(kāi)場(chǎng)中的各種行為,但消除了懸空站立和扶壁站立頻率的性別差異。高架十字迷宮行為結(jié)果表明:BPA暴露顯著減少雄鼠進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)和停留時(shí)間(P<0.05和P<0.01),卻顯著增加雌鼠進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)和停留時(shí)間(P<0.05和P<0.01)；同

7、時(shí),BPA暴露顯著減少雄鼠(P<0.05和P<0.01)卻增加雌鼠在中央?yún)^(qū)的探頭次數(shù)(P<0.01),消除甚至反向誘導(dǎo)小鼠焦慮行為和探究行為的性別分化。水迷宮行為顯示:BPA(40μg／kg／d)暴露顯著延長(zhǎng)雄鼠在水迷宮中搜尋平臺(tái)的平均距離(P<0.05),但對(duì)雌鼠沒(méi)有影響,BPA因此消除了正常成年小鼠空間記憶行為的性別差異。BPA(40 μg／kg／d)暴露顯著縮短了雄鼠在遭電擊24h后跳下平臺(tái)的潛伏期(P<0.05)但對(duì)雌鼠沒(méi)有明顯

8、影響,并誘導(dǎo)成年小鼠被動(dòng)回避行為性別差異。
　　 3、突觸界面結(jié)構(gòu)參數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,BPA暴露沒(méi)有影響突觸數(shù)密度,但BPA(40、400μg／kg／d)暴露改變了突觸界面結(jié)構(gòu)修飾。與同性別對(duì)照組相比,BPA(40、400μg／kg／d)顯著增大雌、雄小鼠突觸間隙寬度(P<0.05或P<0.01),減小雌、雄小鼠PSD厚度(P<0.05或P<0.01),顯著縮短雌、雄小鼠的活性帶長(zhǎng)度(P<0.05或P<0.01),對(duì)突觸界面曲率沒(méi)

9、有影響。此外,BPA暴露40μg／kg／d的BPA使突觸間隙寬度出現(xiàn)明顯的性別差異(P<0.05),表現(xiàn)為雌鼠大于雄鼠。
　　 4、HE染色結(jié)果顯示,BPA暴露對(duì)小鼠海馬CA1區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著影響:但免疫組化技術(shù)檢測(cè)到BPA(40、400μg／kg／d)暴露使雌、雄小鼠海馬CA1區(qū)PSD95蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05或P<0.01)；進(jìn)一步Western blot分析發(fā)現(xiàn),BPA(40、400μg／kg／d)暴露顯著下調(diào)雌

10、、雄小鼠海馬NMDA受體NR1和NR2B亞基表達(dá)(P<0.01),其中40μg／kg／d的BPA對(duì)雄性小鼠NR1和NR2B亞基的下調(diào)作用更明顯,不僅消除了正常小鼠NR1亞基表達(dá)的性別差異,同時(shí)還逆轉(zhuǎn)了正常小鼠NR2B亞基表達(dá)的性別差異(雄鼠<雌鼠,P<0.01)。
　　 結(jié)論:青春期至成年早期BPA暴露性別特異性地影響小鼠的多種行為,干擾成年小鼠行為的性別差異,這可能與BPA改變海馬突觸界面結(jié)構(gòu)修飾、下調(diào)突觸蛋白PSD-95表達(dá)