四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物的分離純化和對植物病原真菌的抑菌活性研究.pdf

1、項(xiàng)目組從浙江天目山采集的土壤中分離到一株對多種植物病原真菌具有較強(qiáng)抑制作用的放線菌，鑒定為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628（Streptomyces diastatochromogenes1628）。前期研究中發(fā)現(xiàn)該菌株發(fā)酵液的正丁醇萃取物中含有多種四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物，本研究對正丁醇萃取物進(jìn)行分離純、純化，獲得3種四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物單體，并對它們的抗菌活性進(jìn)行了研究，進(jìn)一步利用核糖體工程技術(shù)（Ribosome engineering）對淀粉

2、酶產(chǎn)色鏈霉菌1628進(jìn)行了遺傳改造，提高了其產(chǎn)素水平。
　　淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628發(fā)酵液正丁醇萃取物經(jīng)過一次大孔樹脂AB-8色譜柱層析、兩次ODS色譜柱層析、TLC分析和HPLC檢測。最終得到三種四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物單體，編號為ODS5-8、ODS5-7-2、ODS-5-7-4。通過質(zhì)譜、核磁共振分析，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道其中ODS5-8被鑒定為四霉素A（Tetramycin A），ODS5-7-2被鑒定為新的四霉素類抗生素，命名為四霉

3、素P（Tetramycin P），ODS5-7-4被鑒定為四烯菌素B（Tetrin B）。
　　建立了四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物高效液相色譜檢測方法，分析方法為：采用Waters Sun Fire C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm)，流動相A為甲醇，B為水，梯度洗脫，流速：1ml/min；檢測波長：304nm，進(jìn)樣量：5μl，柱溫：30℃。繪制Tetramycin A、Tetramycin P、Tetrin B HPLC標(biāo)準(zhǔn)

4、曲線，在25~500mg/L濃度線性范圍內(nèi)，R2依次為0.9914、0.9862、0.9963，線性關(guān)系良好，平均加樣回收率依次為100.83％、100.15%、100.51%，RSD（%）分別為4.57、4.12、7.89，方法準(zhǔn)確可靠。本測定方法簡單、重復(fù)性強(qiáng)，可用于發(fā)酵液中三種四烯化合物在HPLC方法中的定性定量分析。
　　利用菌絲生長速率法研究了Tetramycin A、Tetramycin P對水稻紋枯病菌（Rhizoc

5、torzia solani）、黃瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers.）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）5種常見植物病原真菌的抑菌活性。結(jié)果表明Tetramycin A、Tetramycin P對5種植物病原菌菌絲生長抑制效果較好。Tetramyci

6、n A抑制5種病原菌菌絲生長的EC50值分別為3.93、2.13、3.27、5.36、5.99mg/L，隨著濃度的上升對5種植物病原真菌抑制效果增加，濃度為25mg/L時(shí)平均抑制率為97.7%。Tetramycin P抑制5種病原菌菌絲生長的EC50值分別為3.83、3.29、3.31、4.96、5.65mg/L，隨著濃度的上升對5種植物病原真菌抑制效果增加，濃度為30mg/L時(shí)平均抑制率為97.3%。利用孢子萌發(fā)率測定法測定Tetra

7、mycin A、Tetramycin P對黃瓜枯萎病菌和番茄灰霉病菌的孢子萌發(fā)率的影響，結(jié)果表明對兩種病原菌孢子萌發(fā)抑制效果較好。Tetramycin A在濃度為125mg/L時(shí)，對番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)抑制效果較好，孢子萌發(fā)率為0%，黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)率為4%，效果稍弱但仍顯著低于對照。Tetramycin P在濃度為75mg/L時(shí)，對番茄灰霉病菌孢子抑制效果較好萌發(fā)率為0%，黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)率為5%，效果稍弱但仍顯著低于對照。實(shí)

8、驗(yàn)表明Tetramycin A、Tetramycin P對常見的5種植物病原菌均有較好的抑菌活性。
　　淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628可以合成四種不同的抗生素包括豐加霉素、Tetramycin A、Tetramycin P和Tetrin B。利用核糖體工程技術(shù)由鏈霉素、利福平、巴龍霉素、紅霉素、慶大霉素和四環(huán)素6種抗生素誘導(dǎo)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628突變，得到抗性突變株SD10、SD88、SD99、SD143、SD160、SD189和SD

9、218，其中SD10、SD143為低濃度鏈霉素和高濃度鏈霉素誘導(dǎo)突變得到。7株突變株中，由紅霉素誘導(dǎo)得到的突變株SD160產(chǎn)生的豐加霉素和Tetramycin A的濃度達(dá)到678mg/L和1005mg/L，分別為野生型1628產(chǎn)量的3.8和5.4倍；由巴龍霉素誘導(dǎo)得到的突變株SD99產(chǎn)生的Tetramycin P和Tetrin B的濃度達(dá)到1015mg/L和583mg/L，分別為野生型1628產(chǎn)量的3.8和5.1倍。結(jié)果表明核糖體工程技