云南牛肝菌的分子鑒定及其多糖抗氧化性研究.pdf

1、牛肝菌是一種著名的食藥兩用真菌，我國(guó)云南牛肝菌分布廣、種類多，是牛肝菌資源的自然分布中心，但由于各種人為和自然因素的影響，使得我國(guó)牛肝菌的種質(zhì)資源受到嚴(yán)重破壞，多樣性逐漸下降。我國(guó)對(duì)牛肝菌資源的利用雖有悠久的歷史，但對(duì)該資源的分類鑒定、有效保護(hù)及綜合開發(fā)利用研究均仍較為滯后，對(duì)牛肝菌資源的了解十分有限。本研究比較研究了采自云南玉溪、楚雄、曲靖和文山4個(gè)地區(qū)的13個(gè)牛肝菌樣品的形態(tài)特征差異，并采用rDNA ITS序列分析、rDNA IGS

2、1序列分析、ITS-RFLP以及IGS1-RFLP等多種分子標(biāo)記相結(jié)合的分子生物學(xué)分析手段對(duì)13個(gè)牛肝菌樣品進(jìn)行分子鑒定和遺傳差異分析。本研究將形態(tài)學(xué)分類法和分子分類法相結(jié)合研究了牛肝菌的遺傳多樣性以及品種間親緣關(guān)系，同時(shí)，本論文通過組織分離法得到牛肝菌內(nèi)生真菌并通過ITS序列分析對(duì)其進(jìn)行分類鑒定，還對(duì)牛肝菌主要活性物質(zhì)多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。以上各方面的研究結(jié)果以期為云南牛肝菌資源的有效保護(hù)、合理開發(fā)和綜合利用提供基礎(chǔ)資料

3、和科學(xué)依據(jù)。主要結(jié)論如下：
　?。?）本研究根據(jù)所得樣品的形態(tài)特征，并采用rDNA ITS序列分析、rDNA IGS1序列分析、ITS-RFLP以及IGS1-RFLP等多種分子標(biāo)記相結(jié)合的分子生物學(xué)分析手段對(duì)13個(gè)牛肝菌樣品進(jìn)行分子鑒定和遺傳差異分析，結(jié)果表明，用幾種不同的分子標(biāo)記技術(shù)獲得的分類結(jié)果基本吻合，相互印證。其中ITS和IGS1序列聚類分析均將13個(gè)樣品聚類為7個(gè)不同類群，兩種方法聚類結(jié)果完全統(tǒng)一，且與傳統(tǒng)的形態(tài)分類結(jié)果

4、基本一致。ITS序列分析作為牛肝菌鑒定鑒別的一種普遍有效的分子手段，能將云南不同產(chǎn)地的13個(gè)牛肝菌樣品鑒定到屬甚至種的水平。此外，研究還發(fā)現(xiàn)IGS1序列與ITS序列分析具有同樣的鑒定效果，IGS1序列分析也可以作為牛肝菌分類鑒定的一種新的分子手段；本項(xiàng)目還開展了對(duì)ITS序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究，rDNA ITS序列的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)水平的分析鑒定結(jié)果與ITS序列聚類分析結(jié)果也相統(tǒng)一，所以ITS的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析也可作為ITS序列分析的一種輔助

5、手段，二者相結(jié)合能為牛肝菌的分子鑒定提供更加豐富和準(zhǔn)確有效的“分子形態(tài)信息”；ITS-RFLP指紋圖譜分類結(jié)果和IGS1-RFLP指紋圖譜分類結(jié)果分別與對(duì)應(yīng)的ITS聚類分析結(jié)果和IGS1聚類分析結(jié)果基本吻合，可見ITS-RFLP和IGS1-RFLP指紋圖譜的構(gòu)建同樣可以作為ITS和IGS1序列分析的一種有效的輔助分析手段，可以直接有效的對(duì)13個(gè)樣品的親緣關(guān)系進(jìn)行初步分類鑒定。實(shí)驗(yàn)研究中還發(fā)現(xiàn)個(gè)別牛肝菌樣品的ITS序列較保守，在2種限制性

6、內(nèi)切酶的酶切圖譜中沒有明顯的限制酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性，因此需要結(jié)合其它種類的內(nèi)切酶來研究牛肝菌的ITS-RFLP，以便將未能區(qū)分開的幾個(gè)種區(qū)別開來?？傊?，采用多種現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法再和傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類法相結(jié)合，可為云南牛肝菌的分類鑒定研究和遺傳多樣性分析提供更加豐富和全面有效的分子信息，且二者的結(jié)果相互印證，更加準(zhǔn)確可靠。
　?。?）選取所得樣品中4種長(zhǎng)勢(shì)較好的牛肝菌為材料，經(jīng)無菌技術(shù)分離子實(shí)體內(nèi)部組織培養(yǎng)，從中獲得7株內(nèi)生真菌

7、，其中MW5-1、MW5-2、MW1-7和MW3-7均分離于美味牛肝菌(Blotus edulis)、HNG1-6分離于皺蓋疣柄牛肝菌(Leccinum rugosiceps）、TS3-6分離于銅色牛肝菌（Boletus aereus）、HL3-8分離于華麗牛肝菌（Blotus magnificus）。根據(jù)菌株的形態(tài)特征和ITS序列分析，7株分離自云南不同地區(qū)的牛肝菌的內(nèi)生真菌分別鑒定為：MW5-1為煙曲霉（Aspergillusfum

8、igatus），MW5-2為淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum），HNG1-6為毛栓菌（Trametes hirsuta），MW1-7為金色毛殼菌（Chaetomium aureum），TS3-6為假絲酵母屬真菌(Candida sp.)，MW3-7為被孢霉屬真菌(Mortierella sp.)，HL3-8散囊菌屬真散囊菌屬真菌(Eurotium sp.)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見所獲的牛肝菌內(nèi)生真菌差異較大，初步顯示

9、了云南野生牛肝菌內(nèi)生真菌的多樣性特征。
　?。?）本研究選用產(chǎn)自云南的五種野生食用牛肝菌：銅色牛肝菌（Boletus aereus）、美味牛肝菌（Boletus edulis）、紅柄牛肝菌（Boletus erythropus）、小美牛肝菌（Boletus speciosus）和黃皮疣柄牛肝菌（Leccinum crocipodium）為研究對(duì)象，通過熱水浸提，乙醇醇析和Sevag法脫蛋白等方法提取并純化其所含多糖，測(cè)定各種總糖含

10、量，然后比較牛肝菌種間多糖的抗氧化能力差異。結(jié)果表明：牛肝菌多糖對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基均有不同程度的清除活性，從整體上看，對(duì)三種自由基的清除能力是DPPH·＞·OH＞O2-·，不同種的牛肝菌對(duì)同種自由基顯現(xiàn)出不同的清除效果，其中對(duì)OH·的清除效果為：黃皮疣柄牛肝菌＞紅柄牛肝菌＞銅色牛肝菌＞小美牛肝菌＞美味牛肝菌；對(duì)O2-·的清除效果為：小美牛肝菌＞美味牛肝菌＞黃皮疣柄牛肝菌＞銅色牛肝菌＞紅柄牛肝菌；對(duì)DPPH·的