牛奶中三聚氰胺的ELISA和可視化納米金快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、食品安全直接關(guān)系到人類的健康和生命安全，是關(guān)乎國(guó)計(jì)民生的大事，是當(dāng)今全世界共同關(guān)注的重大問題。我國(guó)食品安全問題正面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，尤其是乳制品行業(yè)。2008年發(fā)生的三鹿奶粉違法添加三聚氰胺事件，使得食品安全問題再次成為全民關(guān)注的焦點(diǎn)。為解決現(xiàn)有常規(guī)檢測(cè)技術(shù)難以滿足現(xiàn)場(chǎng)和快速檢測(cè)需要的缺陷，研究建立快速、簡(jiǎn)便的三聚氰胺檢測(cè)方法對(duì)保證乳制品的質(zhì)量安全，維護(hù)人民的身體健康和消費(fèi)者的合法權(quán)益，促進(jìn)奶制品行業(yè)的健康發(fā)展均具有十分重要的社會(huì)意義和應(yīng)

2、用價(jià)值。本研究以三聚氰胺為靶標(biāo)物，分別基于免疫學(xué)原理與納米金顯色技術(shù)設(shè)計(jì)建立兩種快速檢測(cè)方法。
　　1.三聚氰胺半抗原的改造及鑒定，完全抗原的合成及鑒定
　　首先對(duì)三聚氰胺半抗原進(jìn)行改造，選用三聚氰胺的衍生物（2-氯-4，6-二氨-1，3，5-三嗪）對(duì)其進(jìn)行羧基化修飾，用3-巰基丙酸取代三聚氰胺結(jié)構(gòu)上的氯原子，并對(duì)改造后的羧基化三聚氰胺進(jìn)行核磁共振-氫譜、碳譜及質(zhì)譜鑒定。通過活性酯法將羧基化三聚氰胺與載體蛋白BSA、OVA分

3、別進(jìn)行偶聯(lián)，合成三聚氰胺完全抗原(MEL-BSA、MEL-OVA)。對(duì)獲得的完全抗原進(jìn)行SDS-PAGE及質(zhì)譜鑒定，表明三聚氰胺完全抗原制備成功。
　　2.三聚氰胺多抗制備及ELISA研究方法的初步建立
　　用獲得的完全抗原進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫，采用MEL-BSA與等量弗氏佐劑（FA）混合，小劑量中程免疫的方法免疫6周齡雌性Balb/C小鼠，免疫間隔時(shí)間為兩周，免疫小鼠分A、B兩組各6只，不同劑量同步免疫。每次免疫后斷尾采血，間

4、接ELISA測(cè)定抗血清的效價(jià)，結(jié)果顯示四免后B組抗血清效價(jià)均達(dá)到或高于1∶20000，且抗血清對(duì)目標(biāo)小分子具有較高特異性和親和力。隨后對(duì)B組小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，并于免疫7天后眼眶采血，經(jīng)免疫親和層析柱純化后得到多克隆抗體。建立針對(duì)三聚氰胺的間接ELISA分析方法，測(cè)得其回歸方程為:Y=-46.8376+27.4957 X，R2為0.9938，經(jīng)計(jì)算得出其靈敏度(IC50)值為3.33 mg/kg，最低檢出限(LOD)為0.117mg/kg

5、，檢測(cè)區(qū)間在0.270～41.02 mg/kg。通過與三嗪類及結(jié)構(gòu)功能類似物的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證所制備的抗體具有較好的特異性。精密度實(shí)驗(yàn)表明該方法的重復(fù)性較好，為ELISA檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　3.基于納米金探針快速可視化檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的方法研究
　　本實(shí)驗(yàn)以納米金顆粒(gold nanoparticles，Au NPs)為探針，研究建立了一種高效、可靠、低成本的比色檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的方法，并基于此方法設(shè)計(jì)研

6、發(fā)了三聚氰胺快速檢測(cè)試劑盒。其原理是由于三聚氰胺可通過氫鍵作用快速誘導(dǎo)納米金聚集，從而引起納米金光學(xué)性質(zhì)改變，表現(xiàn)為隨著三聚氰胺濃度增大，納米金溶液顏色由酒紅色向藍(lán)紫色變化，從而反映受檢樣品中三聚氰胺的濃度。本實(shí)驗(yàn)用硼氫化鈉法及檸檬酸鈉法制備不同粒徑的Au NPs，并通過肉眼、可見光譜及透射電鏡法對(duì)其進(jìn)行表征。隨后考察了納米金檢測(cè)方法的靈敏度、穩(wěn)定性及聚集動(dòng)力學(xué)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5 nm粒徑的Au NPs最適合作為檢測(cè)探針。在此基礎(chǔ)上，對(duì)

7、納米金探針的各方面性能進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果表明納米金探針具有較好的選擇性和抗干擾能力;同時(shí)對(duì)樣品的前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，不僅可以滿足納米金對(duì)三聚氰胺快速檢測(cè)的要求，而且也可以達(dá)到簡(jiǎn)化操作過程提高檢測(cè)效率的目的。從而建立了基于Au NPs的快速可視化檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的方法。
　　4.基于納米金探針快速可視化檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的試劑盒研發(fā)
　　實(shí)驗(yàn)方法建立后，以Au NPs為探針設(shè)計(jì)研發(fā)了三聚氰胺比色檢測(cè)試劑盒。本實(shí)驗(yàn)首先是用硼氫化

8、鈉法制備5nm粒徑的Au NPs，并制作標(biāo)準(zhǔn)比色卡，該標(biāo)準(zhǔn)比色卡是通過一系列含有不同濃度的MEL牛奶標(biāo)樣與5 nm的Au NPs顯色反應(yīng)后的色差制備。該方法在一定程度上克服了傳統(tǒng)檢測(cè)中存在的問題，比現(xiàn)有方法簡(jiǎn)便易行，反應(yīng)迅速，無需儀器，在室溫條件下，從樣品預(yù)處理到結(jié)果檢出只需10min，通過肉眼判別比色卡實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛奶中三聚氰胺的定性和半定量化檢測(cè)，其檢測(cè)范圍是1～120 mg/L，其檢出限已達(dá)到了國(guó)標(biāo)要求。當(dāng)與紫外可見分光光度計(jì)聯(lián)用時(shí)，