巨噬細(xì)胞特異表達(dá)共刺激分子VSIG4對(duì)腎小管間質(zhì)損傷的保護(hù)作用.pdf

1、背景與目的：
　　 腎小管間質(zhì)損害是各種終末期腎病的共同通路，其病變程度與慢性腎病患者預(yù)后密切相關(guān)。腎小管間質(zhì)的損害是以間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征，其中尤其以T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化最為關(guān)鍵。這些浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞通過(guò)分泌炎癥因子可激活局部炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起小管間質(zhì)損害和纖維化。有效減輕腎小管間質(zhì)炎癥及纖維化反應(yīng)，對(duì)減緩腎臟病變向終末期腎臟疾病發(fā)展具有尤為重要的意義。
　　 共刺激分子是一類(lèi)細(xì)胞膜表面分子，可分別為T(mén)、B細(xì)

2、胞的活化提供必要的輔助信號(hào)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、活化及分化。近年來(lái)在腎臟疾病的實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)對(duì)CD28、CD40和ICOS等共刺激途徑的抑制來(lái)間接誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞的無(wú)能，以達(dá)到減少腎組織損傷的目的，已經(jīng)取得了一定的效果。VSIG4(V-set and immunoglobulindomain-containing protein 4)又稱(chēng)補(bǔ)體受體Ig 超家族分子(Complement receptor of theimmunoglobu

3、lin superfamily，CRIg)，或Ig 超家族蛋白-39(Ig superfamily protein 39,Z39Ig)，為I 型跨膜分子，是新近鑒定的對(duì)T細(xì)胞的活化和存活具有重要調(diào)節(jié)作用的B7家族共刺激分子。VSIG4 主要表達(dá)在單核來(lái)源的巨噬細(xì)胞上，在成人體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞主要分布的組織如肝、肺等均有VSIG4mRNA的表達(dá)。近期研究顯示，VSIG4 可交聯(lián)其尚未知的受體分子抑制T細(xì)胞活化，發(fā)揮共抑制分子配體的功能。前期

4、在對(duì)腎病患者腎活檢標(biāo)本的研究中發(fā)現(xiàn)所有標(biāo)本均有不同程度的T細(xì)胞浸潤(rùn)，而T細(xì)胞周?chē)胸S富的巨噬細(xì)胞；該群巨噬細(xì)胞特異表達(dá)VSIG4，且VSIG4 主要表達(dá)在小管間質(zhì)損傷輕的區(qū)域。我們推測(cè)巨噬細(xì)胞表達(dá)的VSIG4 發(fā)揮共刺激分子配體的作用，通過(guò)與T細(xì)胞表面尚未知的受體作用，抑制T細(xì)胞的活化，降低T細(xì)胞炎癥因子分泌，減低T細(xì)胞對(duì)鄰近細(xì)胞的活化，從而改善腎間質(zhì)炎癥及纖維化的病理進(jìn)程。
　　 本試驗(yàn)擬采用VSIG4基因敲除(VSIG4-/

5、-）小鼠及VSIG+/+小鼠建立單側(cè)輸尿管梗阻(UnilaterAlureterAlocclusion，UUO)模型，通過(guò)比較兩組腎小管間質(zhì)損傷程度及體內(nèi)T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞功能的差異，探討VSIG4對(duì)腎小管間質(zhì)損傷的治療作用及其機(jī)制。為腎間質(zhì)炎癥及纖維化的防治尋找新的思路。方法：
　　 SPF級(jí)雄性C57B6(VSIG4-/-及VSIG4+/+）小鼠共40只，其中VSIG4-/-組、VSIG4+/+組小鼠各20只，兩組小鼠分別行左

6、側(cè)輸尿管結(jié)扎，建立單側(cè)輸尿管梗阻(UnilateralureterAlocclusion，UUO)模型，并分別于假手術(shù)對(duì)照組、術(shù)后3、7、14天取小鼠左腎(每個(gè)時(shí)相點(diǎn)各5只小鼠，對(duì)照組剖腹不結(jié)扎)，HE 染色觀察左側(cè)腎臟腎小管損傷及間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，生化指標(biāo)檢測(cè)小鼠血肌酐、尿素氮，免疫組化觀察腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrixmetal

7、loproteinase 2，MMP-2)、CD3+T細(xì)胞及CD68+巨噬細(xì)胞，免疫熒光觀察CD3+、CD4+及CD8+T細(xì)胞變化情況，Real-time PCR 觀察白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)、腫瘤壞死因子-α(Tumour necrosis factor-α，TNF-α）、γ-干擾素(Interleukin-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)的表達(dá)，比較兩組之間

8、的差別，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果顯示：
　　 ①I(mǎi)L-2 mRNA在VSIG4+/+組術(shù)后表達(dá)量增加(p＜0.05)，術(shù)后14天表達(dá)量達(dá)高峰；
　　 在VSIG4-/-組術(shù)后表達(dá)量也增加(p<0.05)，術(shù)后14天達(dá)高峰。VSIG4-/-組IL-2在術(shù)后3天、14天表達(dá)較VSIG4+/+組相同時(shí)相點(diǎn)表達(dá)增多。
　　 IFN ②-γ mRNA在VSIG4-/-及VSIG4+/+組術(shù)后腎組織中均有表達(dá)，

9、術(shù)后7天、14天VSIG4+/+組IFN-γ表達(dá)量較術(shù)后3天明顯增加(p<0.01)；術(shù)后7天、14天VSIG4-/-組IFN-γ表達(dá)也較術(shù)后3天增加(p<0.05)。VSIG4-/-組術(shù)后IFN-γ表達(dá)較VSIG4+/+組相同時(shí)相點(diǎn)表達(dá)明顯增多(p<0.01)。
　　 IL ③-10mRNA在VSIG4+/+組腎組織隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸增加(p<0.05)，同樣在VSIG4-/-組術(shù)后IL-10隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量也逐漸增

10、加(p<0.01)。但I(xiàn)L-10mRNA在VSIG4-/-組術(shù)后14天表達(dá)較VSIG4+/+組相同時(shí)相點(diǎn)表達(dá)明顯減少。
　　 TNF ④-αmRNA在VSIG4+/+組術(shù)后3天腎組織中的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差別(p＞
　　 0.05)，術(shù)后7天表達(dá)開(kāi)始增加；在VSIG4-/-組TNF-α的表達(dá)隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加(p＜0.05)。VSIG4-/-組TNF-α術(shù)后7天、14天表達(dá)較VSIG4+/+組同期表達(dá)增多(p<0.

11、05)。
　　 5、免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示：VSIG4+/+組腎組織中術(shù)后CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞均隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增加；在VSIG4-/-組表達(dá)趨勢(shì)同VSIG4+/+組術(shù)后；然而，在VSIG4-/-組術(shù)后表達(dá)較同期VSIG4+/+組表達(dá)上調(diào)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：VSIG4+/+組術(shù)后CD68+巨噬細(xì)胞隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增加，術(shù)后7天達(dá)高峰，在VSIG4-/-組中表達(dá)趨勢(shì)相同，但VSIG4-/-組術(shù)后表達(dá)與同期V

12、SIG4+/+組表達(dá)無(wú)顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)成功制備VSIG4+/+及VSIG4-/-單側(cè)輸尿管梗阻小鼠動(dòng)物模型。
　　 2.vsIG4-/-組小鼠術(shù)后腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)及小管損傷重于VSIG4+/+組小鼠。提示VSIG4 可抑制單側(cè)輸尿管梗阻小鼠的腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)和腎間質(zhì)纖維化。
　　 3.在VSIG4+/+組腎組織中TGF-β1表達(dá)隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)行性增加；MMP-2表達(dá)在術(shù)后3天達(dá)峰