胞紅蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用.pdf

1、[目的]胞紅蛋白（cytoglobin，CYGB）是一種新發(fā)現(xiàn)的攜氧球蛋白，CYGB在神經(jīng)細(xì)胞缺氧時(shí)表達(dá)明顯增加并具有明顯的細(xì)胞保護(hù)作用。本文探討巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激過(guò)程中 CYGB表達(dá)模式；構(gòu)建CYGB過(guò)表達(dá)/低表達(dá)巨噬細(xì)胞模型，研究CYGB在氧化應(yīng)激過(guò)程中對(duì)巨噬細(xì)胞的作用。
　　[方法]1、將小鼠巨噬細(xì)胞株 RAW264.7、人巨噬細(xì)胞株THP-1、EC及人肝癌細(xì)胞HepG2擴(kuò)增后，Western blot檢測(cè)正常生理狀態(tài)下RAW

2、264.7、THP-1、EC及HepG2細(xì)胞中CYGB蛋白的表達(dá)水平。2、將小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7擴(kuò)增后，Western blot檢測(cè)RAW264.7在H2O2刺激不同時(shí)間時(shí)CYGB的蛋白表達(dá)水平：分為4組:對(duì)照組，0.5mmol/L H2O2處理6、12、24 h組。Western blot檢測(cè)RAW264.7在不同濃度H2O2刺激12h時(shí)CYGB蛋白的表達(dá)水平：分為4組：對(duì)照組，0.25mmol/L H2O2、0.5mmol

3、/L H2O2、1mmol/L H2O2處理組。3、首先構(gòu)建CYGB過(guò)表達(dá)/低表達(dá)巨噬細(xì)胞模型。然后觀察在氧化應(yīng)激過(guò)程中 CYGB對(duì) RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞的作用，將RAW264.7細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、0.5mmol/L H2O2處理組、0.5mmol/L H2O2+CYGB過(guò)表達(dá)組及0.5mmol/L H2O2+CYGB低表達(dá)組。于12h后，檢測(cè) CYGB蛋白水平、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）、乳酸脫氫（LDH）、丙二醛

4、（MDA）、活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）；熒光定量 PCR檢測(cè) CYGB、NF-κB在細(xì)胞中的表達(dá)。
　　[結(jié)果]1、Western blot結(jié)果顯示：在正常生理狀態(tài)下，CYGB在小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7、人巨噬細(xì)胞株THP-1、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EC及人肝癌細(xì)胞HepG2中均有表達(dá)。2、Western blot結(jié)果顯示：H2O2處理6、12、24 h組CYGB表達(dá)水平高于對(duì)照組，并且在12h組CYGB表達(dá)水平最

5、高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。0.25mmol/L H2O2、0.5mmol/L H2O2和1mmol/L H2O2處理巨噬細(xì)胞12h后CYGB表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。3、熒光顯微鏡結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染CYGB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及 CYGB低表達(dá)質(zhì)粒的巨噬細(xì)胞在熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光。4、Western blot結(jié)果顯示：0.5mmol/L H2O2處理組、0.5mmol/L H2O2+CYGB過(guò)表達(dá)組及0.5

6、mmol/L H2O2+CYGB低表達(dá)組CYGB蛋白表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。0.5mmol/L H2O2+CYGB過(guò)表達(dá)組的CYGB表達(dá)最高（P<0.05），0.5mmol/L H2O2+CYGB低表達(dá)組的CYGB表達(dá)較0.5mmol/L H2O2處理組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）和ROS檢測(cè)結(jié)果顯示：與0.5mmol/L H2O2相比，0.5mmol/L H

7、2O2+CYGB過(guò)表達(dá)組中GSH-PX、SOD升高，LDH、MDA、ROS下降；與0.5mmol/L H2O2組相比，0.5mmol/L H2O2+CYGB低表達(dá)組中GSH-PX、SOD下降，LDH、MDA、ROS升高。熒光定量PCR檢測(cè)顯示：與正常對(duì)照組比較，H2O2處理組CYGB和NF-κB表達(dá)均上調(diào)（P<0.05）。與 H2O2對(duì)照組比較，CYGB過(guò)表達(dá)組CYGB表達(dá)較高，NF-κB表達(dá)較低（P<0.05）；CYGB低表達(dá)組CYG