基于csaB基因和質(zhì)粒組的蠟狀芽胞桿菌群的分型以及進(jìn)化.pdf

1、蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)群包括產(chǎn)炭疽毒素的炭疽芽胞桿菌(B.anthracis)，機(jī)會(huì)致病菌蠟狀芽胞桿菌(B.cereus)，產(chǎn)殺蟲晶體蛋白并且被廣泛用于生物防治的蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)，以及其它幾種芽胞桿菌。正是由于其中一部分菌株對(duì)人類健康構(gòu)成威脅，而另一部菌株則可以用于生物農(nóng)藥的開發(fā)，而且這個(gè)群的菌株廣泛存在于自然界的各個(gè)生境，對(duì)于菌株之間的區(qū)分一直以來受到研究者的重視。由于已經(jīng)報(bào)道的針

2、對(duì)于B.cereus群的鑒定分型方法分辨率不夠，很多不同的菌株不能有效地相互區(qū)分。對(duì)于B.thuringiensis菌株而言，由于挖掘更多的具有應(yīng)用價(jià)值的活性物質(zhì)需要分離鑒定到更多的新型菌株，而傳統(tǒng)的使用H-血清型鑒定的方法已經(jīng)停止使用，所以急需建立新型有效的鑒定方法。大規(guī)模的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的公開，為研究新型的用于區(qū)分的新型基因提供基礎(chǔ)。本研究著眼于尋找新型的基于核苷酸序列的菌株分型方法，并且研究分型結(jié)果所反映的生態(tài)與進(jìn)化的規(guī)律，為B.

3、cereus群菌株大規(guī)模的鑒別以及進(jìn)化研究提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)考察新型分型系統(tǒng)對(duì)于B.thuringiensis菌株的鑒定的有效性。
　　由于水平基因轉(zhuǎn)移是細(xì)菌基因組的主要驅(qū)動(dòng)力，而質(zhì)粒是這個(gè)過程中的主要媒介，因此對(duì)于質(zhì)粒的起源、進(jìn)化、動(dòng)態(tài)以及與染色體的具體關(guān)系的研究對(duì)于解釋微生物基因組的進(jìn)化規(guī)律至關(guān)重要。B.cereus群不同的菌株含不同數(shù)量、不同種類以及不同大小質(zhì)粒，有些菌株甚至含有超過10個(gè)大小從2kb到600kb的質(zhì)粒，而且

4、本實(shí)驗(yàn)室以前的研究顯示，在同一個(gè)菌株中，質(zhì)粒上遺傳物質(zhì)的生物量甚至大于染色體上的。因此，研究丑cereus群質(zhì)粒的進(jìn)化以及與染色體之間的關(guān)系可以為我們認(rèn)識(shí)質(zhì)粒在細(xì)菌進(jìn)化中的作用與地位提供幫助。同時(shí)，到目前為止，超過100個(gè)來自B.cereus群的質(zhì)粒的基因組序列被公開，為系統(tǒng)性地研究質(zhì)粒的進(jìn)化與動(dòng)態(tài)提供基礎(chǔ)。本研究著重研究普遍存在于B.cereus中的大于100kb的質(zhì)粒的進(jìn)化，以及把整個(gè)B.cereus群質(zhì)粒作為一個(gè)整體，研究其與染色

5、體之間的關(guān)系，在細(xì)菌種群水平揭示質(zhì)粒的起源于動(dòng)態(tài)以及對(duì)于種群形成和穩(wěn)定的作用。
　　通過分析大量的B.cereus群菌株的基因組，我們發(fā)現(xiàn)其中含有大量的具有潛在生物活性物質(zhì)的基因。其中，細(xì)菌素的合成基因簇是非常豐富的一類。細(xì)菌素是一類對(duì)于與產(chǎn)生菌近緣的細(xì)菌有活性的抗微生物物質(zhì)，其化學(xué)本質(zhì)是由核糖體合成的多肽或者蛋白質(zhì)類物質(zhì)。其在醫(yī)學(xué)中的潛在應(yīng)用以及在微生物生態(tài)中重要作用，使其越來越受重視。由于芽胞桿菌同時(shí)也是人類微生物組中的主要成

6、員，本研究通過研究人類不同身體位點(diǎn)微生物組中細(xì)菌素的多樣性以及分布規(guī)律，結(jié)合各個(gè)微生物組的細(xì)菌群落組成，嘗試揭示細(xì)菌素在人類微生物組的動(dòng)態(tài)平衡中的重要作用。
　　1)使用csaB基因?qū).cereus群菌株進(jìn)行分型能夠反映其宿主類型
　　目前很多標(biāo)志基因被用來鑒定和區(qū)分蠟狀芽胞桿菌(B.cereus)群不同的菌株，但是大部分的標(biāo)志基因序列變異性較低，區(qū)分效果不理想。本研究報(bào)道一個(gè)S-層蛋白錨定相關(guān)基因csaB來區(qū)分B.cer

7、eus群菌株以及評(píng)估其在蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)菌株鑒定與區(qū)分中的作用。
　　首先，csaB的系統(tǒng)發(fā)育樹與已報(bào)道的標(biāo)志基因的系統(tǒng)發(fā)育樹具有相似但不相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，而序列具有更大的變異性，不同菌株之間的一致性在78％～100％，而其它已經(jīng)報(bào)道過的標(biāo)志基因，不同菌株之間的一致性一般都在85％以上。我們測(cè)序獲得76株B.thuringiensis菌株的csaB基因，結(jié)合從Genbank獲得122株B.cereus

8、群菌株獲得的序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。所有被分析的群菌株主要被聚集到兩個(gè)大的類群。其中，所有的B.anthracis菌株具有相同的csaB基因，可以與其它的菌株區(qū)分開，而B.cereus和B.thuringiensis菌株則不能被相互區(qū)分開，來自這兩個(gè)種的菌株離散地分布于兩個(gè)類群中。
　　基于兩個(gè)大類，超過80％分離自高等動(dòng)物的菌株集中在Ⅰ類，22株分離自昆蟲的菌株中，20株集中在Ⅱ類，而分離自土壤的在兩個(gè)大類中均勻分布。并且一些有助

9、于細(xì)菌粘著以及編碼與高等動(dòng)物相互作用的表面蛋白的基因，SLH蛋白基因的數(shù)目，Ⅰ類菌株的基因組中顯著性(p＜2.2e-16，Mann-Whitneytest)地高于Ⅱ類菌株的基因組中。我們推測(cè)兩個(gè)大類可能反映出B.cereus群的兩種不同的動(dòng)物宿主，即高等動(dòng)物和昆蟲。
　　2)使用csaB基因能夠?qū).thuringiensis菌株進(jìn)行有效的區(qū)分
　　我們分析了來自70個(gè)血清型的109個(gè)B.thuringiens菌株，發(fā)現(xiàn)它們

10、共享44個(gè)基因型，其中22個(gè)代表一個(gè)血清型，而19個(gè)代表兩個(gè)或者更多個(gè)血清型。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，同一血清型的不同亞型可以明顯地被分開，而同一血清亞型或者血清型（沒有亞型）的菌株被聚集在一起。結(jié)合已報(bào)道的鞭毛蛋白序列，所有的血清型以及亞型都可以被明顯地區(qū)分開。
　　總之，基于csaB基因的分型既可以對(duì)B.cereus群的菌株進(jìn)行更精細(xì)的識(shí)別，同時(shí)可以反映B.cereus群祖先的兩種不同動(dòng)物宿主類型，也可以作為一種對(duì)B.thuringi

11、ensis菌株進(jìn)行鑒定區(qū)分的技術(shù)。
　　3)B.cereus群中大于100kb的質(zhì)粒起源于由較小的質(zhì)粒融合事件
　　大部分B.cereus群菌株富含豐富的質(zhì)粒，有的甚至超過10個(gè)。同一菌株中，不同質(zhì)粒的大小各不相同，最大的可以到600kb，最小的只有2kb。目前B.cereus群的質(zhì)粒都是零散地被研究，大部分質(zhì)粒只被報(bào)道了序列或者復(fù)制方式，對(duì)于系統(tǒng)地把整個(gè)B.cereus群的質(zhì)粒當(dāng)成一個(gè)整體來研究的沒有報(bào)道。作為水平基因轉(zhuǎn)移

12、中非常重要的載體，質(zhì)粒在細(xì)菌基因組進(jìn)化過程中起著至關(guān)重要的作用。許多細(xì)菌菌株含有多個(gè)質(zhì)粒，但是這些質(zhì)粒的起源，進(jìn)化和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以及質(zhì)粒和染色體之間的關(guān)系并不清楚。本文中對(duì)這些話題的研究主要通過關(guān)注來自B.cereus群的質(zhì)粒。
　　我們首先通過研究質(zhì)粒的最小復(fù)制子探討了31個(gè)大于100kb的質(zhì)粒的起源，進(jìn)化與動(dòng)態(tài)規(guī)律。這些質(zhì)粒上的65個(gè)潛在的最小復(fù)制子可以根據(jù)復(fù)制相關(guān)蛋白基因以及可能的復(fù)制起點(diǎn)分為6個(gè)大的類型。31個(gè)大質(zhì)粒中的

13、29個(gè)含有兩個(gè)及其以上的最小復(fù)制子。基于復(fù)制相關(guān)蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示位于同一質(zhì)粒上的不同的最小復(fù)制子具有不同的進(jìn)化歷史。因此，我們推測(cè)這些大質(zhì)粒起源于較小的質(zhì)粒的融合事件。由于存在于同一菌株中的質(zhì)粒必須相容，而且B.cereus群中共存于同一菌株中的不同大質(zhì)粒的最小復(fù)制子屬于不同的組或者亞組，因此，最小復(fù)制子的不同亞組可能決定著不同的不相容組性。
　　更為廣泛地分析1285個(gè)具有可預(yù)測(cè)的最小復(fù)制子的細(xì)菌質(zhì)粒顯示，34％(443

14、)的質(zhì)粒具有兩個(gè)或者兩個(gè)以上的最小復(fù)制子，并且這些質(zhì)粒的基因組大小顯著性地大于具有一個(gè)最小復(fù)制子的質(zhì)粒。因此，我們推測(cè)，由質(zhì)粒融合事件形成較大質(zhì)粒的現(xiàn)象在質(zhì)粒的進(jìn)化過程中普遍存在。
　　4)B.cereus群中的質(zhì)粒是其染色體基因冗余的載體
　　我們收集到104個(gè)已知序列的B.cereus群質(zhì)粒，通過關(guān)注質(zhì)粒和染色體之間的共有基因(sharedgenes)來探究質(zhì)粒和染色體之間的關(guān)系。一些基本特征，例如堿基組成(baseco

15、mposition)和密碼子選擇(codonusage)分析顯示位于質(zhì)粒上的基因更接近于染色體上的可變基因，而非染色體的核心基因。盡管所有的染色體基因的COG功能類別在質(zhì)粒的基因中均有代表，但是其比例差異明顯。當(dāng)關(guān)注共有基因在質(zhì)粒和染色體上的分布時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)它們均勻分布。但是，相同的共有基因在染色體和質(zhì)粒上具有不同的啟動(dòng)子和（或）終止子序列，因此在轉(zhuǎn)錄水平上受不同的元件調(diào)控。我們推測(cè)為適應(yīng)多變的環(huán)境，適應(yīng)性相關(guān)的基因可以同時(shí)存在于質(zhì)粒和

16、染色體上，為保證這種冗余只存在于基因水平，這些共有基因通常受不同的調(diào)控元件控制。
　　5)人類微生物組中細(xì)菌素基因的多樣性
　　大量B.cereus群菌株基因組序列被公開，使得通過基因組學(xué)的方法全面挖掘其與其它微生物以及宿主之間相互作用因子成為可能。我們預(yù)測(cè)到大量的具有潛在生物活性的物質(zhì)，包括蛋白酶、抗生素以及細(xì)菌素?；谖覀兊念A(yù)測(cè)，多個(gè)課題小組開展了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證工作，部分成果已經(jīng)公開發(fā)表。本文重點(diǎn)關(guān)注細(xì)菌素。細(xì)菌素通常對(duì)

17、于產(chǎn)生菌近緣的細(xì)菌具有毒殺作用，因此它們?cè)谖⑸锶郝渖鷳B(tài)中作用非常重要。人類不同的身體位點(diǎn)是不同微生物群落的天然棲息地，不同的位點(diǎn)具有不同的微生物圈，每個(gè)微生物圈中，細(xì)菌群落組成往往保持動(dòng)態(tài)平衡。然而影響這些平衡的因子到目前為止還不十分清楚。
　　我們通過尋找已經(jīng)報(bào)道的細(xì)菌素的相似蛋白序列，在人類微生物組的宏基因組數(shù)據(jù)中尋找可能的細(xì)菌素序列，一共預(yù)測(cè)到802個(gè)Ⅰ類細(xì)菌素，3048個(gè)Ⅱ類細(xì)菌素。一方面，不同的位點(diǎn)具有不同豐度的細(xì)菌素

18、，而豐度最高的樣品則來自于口腔，事實(shí)上大部分細(xì)菌素來自口腔樣品。蛋白質(zhì)相似性網(wǎng)絡(luò)分析顯示來自同一位點(diǎn)的細(xì)菌素聚集在一起，并且每個(gè)位點(diǎn)中，少數(shù)幾個(gè)細(xì)菌素占主導(dǎo)。當(dāng)我們關(guān)注預(yù)測(cè)到細(xì)菌素的參照基因組時(shí)，對(duì)于來自口腔樣品中的細(xì)菌素，絕大部分大部分來自口腔優(yōu)勢(shì)菌葡萄球菌(Streptococcus)。對(duì)于其它位點(diǎn)，情況類似，細(xì)菌素所對(duì)應(yīng)的參照基因組主要來自各位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)菌群。我們認(rèn)為細(xì)菌素在形成與維持各個(gè)位點(diǎn)的微生物群落過程中起主要作用。另一方面，