胖大海酸性多糖結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的研究.pdf

1、胖大海(Semen Sterculiae Lychnophera)為梧桐科蘋婆屬植物(Sterculia lychnophora Hance)的干燥成熟種子，是一種傳統(tǒng)的清咽潤(rùn)喉的中藥材，也是衛(wèi)生部公布第三批藥食兩宜的資源。由于受生長(zhǎng)地域環(huán)境和氣候的限制，胖大海主要產(chǎn)于東南亞的熱帶地區(qū)，我國(guó)不產(chǎn)，于20世紀(jì)70年代從柬埔寨和泰國(guó)分別引進(jìn)長(zhǎng)粒和圓粒胖大海，只有在海南和西雙版納兩地生長(zhǎng)良好，但僅有長(zhǎng)粒胖大海在西雙版納已結(jié)果多年，成片種植，故

2、國(guó)內(nèi)胖大海資源主要依靠從東南亞國(guó)家進(jìn)口。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)胖大海的研究較少，僅限于做茶飲、甜點(diǎn)和含片等清咽潤(rùn)喉的保健品，開發(fā)利用程度較低，缺乏對(duì)其活性成分的系統(tǒng)研究和利用。胖大海多糖是胖大海的主要生物活性成分，本課題以越南產(chǎn)胖大海為原料，對(duì)胖大海多糖的提取、分離純化，活性多糖的結(jié)構(gòu)表征和溶液的性質(zhì)進(jìn)行研究，主要研究?jī)?nèi)容如下： 對(duì)胖大?；瘜W(xué)成分的初步分析：粗蛋白12.36％，粗脂肪5.89％，碳水化合物53.23％，還原糖29.45％，

3、結(jié)果發(fā)現(xiàn)胖大海多糖含量豐富。采用去離子水和0.05 mol/L NaOH溶液提取胖大海粗多糖，對(duì)其得率、純度和固有粘度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)水溶性多糖(W-SP)的得率(13.8％)、純度(69.7％)和固有粘度(1.71dL/g)都明顯高于NaOH提取的多糖(A-SP)，分析原因可能在堿性溶液提取過(guò)程中部分多糖發(fā)生降解。 對(duì)W-SP、A-SP和堿不溶性多糖(IMP)的化學(xué)成分、單糖組成以及抗炎活性進(jìn)行研究。分別測(cè)得總糖含量為69.74

4、％、44.14％、80.18％，糖醛酸含量為14.78％、7.35％、5.35％，蛋白質(zhì)含量為9.12％、13.54％、3.45‰發(fā)現(xiàn)三種多糖均由Rha、Ara、Gal、Glc和．Xyl單糖組成，只是含量有所不同，在W-SP和A-SP中Glc的含量均高于IMP多糖。以二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)為模型對(duì)W-SP、A-SP和IMP的急性炎癥抗炎活性進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，W-SP和A-SP均有抑制小鼠耳廓腫脹作用，但W-SP抑制率(17.84％)

5、高于A-SP(4.15％)，IMP基本無(wú)抗炎活性。 運(yùn)用響應(yīng)面分析法以提取得率、純度和相對(duì)粘度為指標(biāo)，優(yōu)化了水溶性粗多糖(W-SP)的提取工藝參數(shù)：提取溫度60-65℃，提取時(shí)間2.3-3.1h，料水比751:1。 水溶性粗多糖經(jīng)過(guò)DEAE纖維素柱層析分離得到兩個(gè)組分：W-SPN為中性多糖，W-SPA為酸性多糖。W-SPN的化學(xué)成分：總糖90.18％，蛋白質(zhì)2.51％，灰分1.17％：主要是由Glc單糖組成。W-SPA的

6、化學(xué)成分：總糖85-86％，蛋白質(zhì)3.029％，灰分4.05％，糖醛酸40.13％；主要由Rha、Ara、Gal、Xyl和Glc單糖組成的；經(jīng)酶法和HPAEC-PAD分析發(fā)現(xiàn)其糖醛酸主要由GalA(96.89％)組成，還有少量GlcA(3.11％)。 經(jīng)Sepharose CL-6B凝膠柱和HPSEC分析發(fā)現(xiàn)，W-SPN和W-SPA都是相對(duì)分子質(zhì)量的均一組分，測(cè)得其相對(duì)分子質(zhì)量分別為586,800 Da和1，125,000 Da

7、；經(jīng)過(guò)單糖組成和FT-IR分析確定W-SPA是一種果膠類多糖，并用FT-IR測(cè)得W-SPA的酯化度為68％。 采用急性炎癥抗炎模型對(duì)W-SPN和W-SPA進(jìn)行活性篩選，結(jié)果表明，W-SPN對(duì)小鼠耳廓腫脹的抑制率(3.21％)遠(yuǎn)低于W-SPA(26.29％)。采用植入棉球致大鼠肉芽組織增生試驗(yàn)為模型，考察了W-SPA的慢性炎癥抗炎活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)W-SPA能抑制肉芽腫28.38％，達(dá)到阿司匹林抑制率(34.38％)的82％，并且發(fā)現(xiàn)

8、W-SPA對(duì)急、慢性炎癥的抗炎活性都具有劑量依賴性。 采用多糖部分酸水解和甲基化分析的化學(xué)方法，結(jié)合HPAEC、GC-MS和1D NMR、2D NMR技術(shù)對(duì)胖大海酸性多糖W_SPA進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，W-SPA主要是由1，4-α-D-GalpA連接形成的半乳糖醛酸聚糖(HG)構(gòu)成的“光滑區(qū)”和由1，4-α-D-GalpA通過(guò)O-4位與1，2-、1，2,4-α-L-Rhap的O-2交替連接形成的鼠李半乳糖醛酸聚糖-I(RG-I

9、)構(gòu)成的“毛發(fā)區(qū)”組成。其中，HG多糖鏈上有部分糖醛酸的羧基被甲酯化，部分的C-2和C-3位被乙?；〈?；RG-I鏈上有62.21％的鼠李糖在O-4位上發(fā)生取代。由T-，1，3-，1，5-L-Araf和T-，1，4-，1，6-，1，3,6-D-Galp連接形成的阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖構(gòu)成了多糖W-SPA的支鏈。55.76％的L-Araf以非還原末端的形式連接在1，3-L-Araf的O-3、1，5-L-Araf的O-5以及1

10、，6．D-Galp的O-3和主鏈?zhǔn)罄钐堑腛-4位上；38.45％的A-Araf構(gòu)成了阿拉伯聚糖。57.17％的D-Galp以非還原末端的形式連接，22.95％的1，6-D-Galp在O-3位上被取代。少量的蛋白質(zhì)可能以O(shè)-糖苷的形式連接在W-SPA的多糖鏈上，但這還需要進(jìn)一步確證。 采用動(dòng)態(tài)和靜態(tài)光散射技術(shù)研究了酸性多糖大分子在溶液中的性質(zhì)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，W-SPA分子在水、5 mol/L，尿素和100 mmol/L NaNO<,

11、3>溶液中均存在聚集，影響了多糖大分子的光散射分析，但在25mmol/L，NaOH溶液中能夠消除分子的聚集現(xiàn)象。采用靜態(tài)光散射技術(shù)測(cè)得W-SPA分子的重均分子量Mw為913,200Da，旋轉(zhuǎn)半徑Rg為51.85 nm，第二維里系數(shù)A<,2>為2.70×10<'-4>cm<'3> mol/g<'2>。用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)得流體動(dòng)力學(xué)半徑Rh為39.3 nin，系數(shù)p=Rg/Rh為1.32表明W-SPA分子在25 mmol/L NaOH溶液中是一

12、種多分支緊湊的無(wú)規(guī)線團(tuán)構(gòu)型。經(jīng)過(guò)HPSEC分析測(cè)得W-SPA的Mark-Houwink-Sakurada方程指數(shù)a為0.586，表明W-SPA為緊湊的無(wú)規(guī)線團(tuán)的分子鏈，p和a所反映的分子構(gòu)型是基本一致的。 對(duì)W-SPA的流變學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。通過(guò)穩(wěn)態(tài)剪切流變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，W-SPA在高濃度下表現(xiàn)的是剪切變稀的非牛頓流體，在低濃度下是典型的牛頓流體。與高甲氧基果膠類似，W-SPA本身不能形成膠體，在酸性和共溶質(zhì)如糖的存在條件下才能形成