Thanatin-PPA融合蛋白的表達和特性研究.pdf

1、掌葉半夏凝集素(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA)是一種從掌葉半夏(Pinellia pedatisecta Schott)塊莖中提取并能夠特異性凝集甘露糖的蛋白,屬于單子葉植物凝集素家族。研究表明,掌葉半夏凝集素具有植物保護、抗腫瘤等功效?？咕?Protegrin)是生物體內的一種具有抗菌活性的內生免疫原性動物蛋白。死亡素(Thanatin)是在昆蟲斑腹刺益蝽(Podisus maculiven

2、tris)中發(fā)現(xiàn),由21個氨基酸殘基組成的抗菌肽,研究表明死亡素對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和某些真菌都有抑制作用。
　　 腫瘤細胞的研究表明,糖鏈在合成水平上的差異和特殊糖基結構同腫瘤細胞的侵染具有相關性,并且掌葉半夏凝集素的融合表達具有識別甘露糖表型的實體腫瘤細胞表面的糖抗原;并且已經從分子水平證實了大部分慢性疾病都是由炎癥反應失調引起的,具有抗菌活性的藥物可能抑制癌癥的發(fā)病或者治療癌癥?；谝陨蟽牲c,本文設計了Thanat

3、in-PPA的融合蛋白,分別保留了掌葉半夏凝集素抗腫瘤活性和死亡素抗菌活性,并且融合蛋白表達時,為了避免融合蛋白表達時影響蛋白高級結構的正確折疊以及蛋白的活性,在兩個蛋白之間引入10個氨基酸殘基的柔性肽。
　　 本文首先通過從掌葉半夏塊莖中提取總RNA,設計引物克隆編碼掌葉半夏凝集素的基因ppa;通過重疊PCR分別將編碼柔性肽基因和死亡素基因融合到ppa5'端,得到編碼融合蛋白的基因ppa-linker-thanatin。融合基

4、因經測序分析顯示克隆成功。
　　 本文將融合基因連接到pET32a表達載體上,轉化到DH5α感受態(tài)細胞中,經酶切鑒定和測序分析,然后轉化到E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞中,IPTG誘導融合蛋白的表達。融合蛋白分子量為32kDa且主要表達在包涵體中,包涵體經洗滌、稀釋復性和純化,用于后續(xù)實驗。
　　 本文構建酵母表達載體pPIC3.5K-pt,重組質粒經酶切鑒定和測序分析顯示構建成功。pPIC3.5K-pt經S

5、alI單酶切線性化后電轉插入到畢赤酵母菌株GS115染色體中。pPIC3.5K/pt在表達培養(yǎng)基中經甲醇誘導表達,蛋白經Ni柱純化后顯示為31kDa左右的單一條帶。
　　 本文進行了原核表達蛋白的凝血活性、抗菌活性和體外抗腫瘤活性的分析。融合蛋白在表達過程中抑制宿主細菌的生長;以半夏新鮮蛋白為對照的凝血活性顯示融合蛋白具有凝集兔血紅細胞的作用,但凝集活性有一定的降低;體外MTT顯示融合蛋白具有顯著的抑制Hela、Beas-2B、