TDRD7單核苷酸多態(tài)性與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的關(guān)聯(lián)分析及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　年齡相關(guān)性白內(nèi)障(Age-related cataract, ARC)是全球最主要致盲眼病之一[1],其主要臨床表現(xiàn)為晶狀體發(fā)生混濁,且患者隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)生無痛性視力下降。隨著人口快速增長(zhǎng)和老齡化,ARC患者數(shù)量將日趨增加[2];雖然白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)能給患者帶來較滿意視力效果,但不可避免的存在一些術(shù)后并發(fā)癥;同時(shí)日益增長(zhǎng)手術(shù)需求加重了社會(huì)經(jīng)濟(jì)問題,其巨額支出給國家及社會(huì)帶來了沉重的醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前研究認(rèn)為ARC

2、為典型的多基因疾病,其發(fā)生發(fā)展與環(huán)境及遺傳等多種因素相關(guān)[3]。
　　真核細(xì)胞胞漿中的RNA顆粒被定義為由不同功能mRNA與蛋白質(zhì)組成的一種亞細(xì)胞單位復(fù)合體,其在轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控中起著十分重要的作用[4]。最新研究表明,RNA顆粒成分的TDRD7(Tudor domain containing protein7,TDRD7)基因與白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),且 TDRD7突變會(huì)導(dǎo)致眾多已知與白內(nèi)障相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生明顯變化。其中

3、與白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制相關(guān)的已知βB3晶狀體蛋白(βB3-crystallin, CRYBB3)與小分子熱休克蛋白1(small Heat shock protein1,HSPB1)可直接與TDRD7相結(jié)合。RNA顆粒成分 TDRD7對(duì)維持晶狀體透明功能發(fā)揮著重要作用[5],但 TDRD7與ARC的遺傳易感性及其在晶狀體功能中作用具體機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　研究目的：
　　采取功能候選基因策略在中國漢族人群中對(duì)TDRD7基因單核

4、苷酸多態(tài)性與ARC易感性進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究,并對(duì)ARC易感位點(diǎn)的功能機(jī)制進(jìn)行初步探討;同時(shí)對(duì)TDRD7介導(dǎo)的HSPB1/CRYBB3信號(hào)通路影響ARC發(fā)生的分子機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　研究方法：
　　1.利用HAPMAP數(shù)據(jù)庫,結(jié)合生物信息學(xué)方法挑選具有潛在生物學(xué)效應(yīng)的TDRD7單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)。
　　2.按照統(tǒng)一的納入排除標(biāo)準(zhǔn)收集ARC患者及健康自愿

5、者的外周靜脈血,抽提基因組DNA;采用SNaPshot方法進(jìn)行基因分型,分析TDRD7基因單核苷酸多態(tài)性在ARC患者及對(duì)照組之間基因型、等位基因頻率,以及與不同類型不同年齡階段的 ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。
　　3.利用免疫組織化學(xué)方法觀察人類晶狀體TDRD7和HSPB1蛋白表達(dá)及定位;利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法在 RNA水平上對(duì)不同年齡不同基因型的皮質(zhì)性 ARC患者晶狀體上皮組織TDRD7、HSPB1和CRYBB3表達(dá)情況進(jìn)行探

6、討。同時(shí)采用Western Blot方法在蛋白水平上觀察不同年齡不同基因型的皮質(zhì)性 ARC患者晶狀體上皮組織HSPB1和CRYBB3表達(dá)變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.利用HAPMAP數(shù)據(jù)庫結(jié)合生物信息學(xué)分析在TDRD7基因及其上游7kb調(diào)控區(qū)域內(nèi)篩選出5個(gè)最小等位基因頻率(Minor Allele Frequency,MAF)大于10％的SNP位點(diǎn)作為研究對(duì)象。這5個(gè)位點(diǎn)分別為位于外顯子誘發(fā)錯(cuò)義突變的 rs2045732及

7、位于TDRD7上游調(diào)控區(qū)個(gè)的4個(gè)SNP位點(diǎn)(rs1462091,rs11793735,rs10981985,rs1462089)。
　　2.在符合納入排除標(biāo)準(zhǔn)的271例正常健康對(duì)照和218例ARC病例中,采用SNaPshot方法對(duì)篩選出的5個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型,5個(gè)位點(diǎn)在病例及對(duì)照中均符合哈溫平衡。分析顯性、隱性、等位基因遺傳模式下各個(gè)SNP位點(diǎn)與ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性,結(jié)果提示 rs10981985位點(diǎn)多態(tài)性與 ARC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相

8、關(guān)。其中 rs10981985A等位基因顯著減低ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(pc=0.01,OR:0.619,95%CI:0.455-0.841),且GA和AA基因型個(gè)體 ARC患病率顯著低于 GG基因型個(gè)體(pc=0.02,OR:0.561,95%CI:0.388-0.809)。而其余4個(gè)位點(diǎn)與ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)均無顯著性差異(pc>0.05)。
　　3.其次在不同類型白內(nèi)障患者中發(fā)現(xiàn),rs10981985位點(diǎn)多態(tài)性與皮質(zhì)性ARC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)程

9、度更高,即 A等位基因降低皮質(zhì)性 ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(pc=0.012,OR:0.502,95%CI:0.315-0.801),GA和AA基因型個(gè)體皮質(zhì)性ARC發(fā)生率顯著低于GG基因型個(gè)體(pc=0.016,OR:0.431,95%CI:0.251-0.740);此外rs10981985GA和AA基因型個(gè)體混合性ARC患病率低于GG基因型個(gè)體(pc=0.048,OR:0.433,95%CI:0.235-0.797)。
　　4.以不同年

10、齡層次將樣本劃分為<65歲及≥65歲兩組,觀察在顯性、隱性、等位基因遺傳模式下rs10981985位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與ARC患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性,結(jié)果提示在≥65歲組人群中rs10981985單核苷酸多態(tài)性與ARC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān),其中在≥65歲組人群中 A等位基因顯著減低 ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(pc=0.004, OR:0.476,95%CI:0.299-0.759),且 AA基因型個(gè)體在≥65歲組人群中 ARC患病風(fēng)險(xiǎn)顯著低于 GG和GA基因型

11、攜帶個(gè)體(pc=0.016,OR:0.086,95%CI:0.011-0.671)。
　　5.將皮質(zhì)性ARC患者以不同年齡層次將樣本劃分為<65歲及≥65歲兩組,觀察在顯性、隱性、等位基因遺傳模式下 rs10981985位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與皮質(zhì)性 ARC患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性,結(jié)果顯示在≥65歲組人群中rs10981985位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與皮質(zhì)性ARC患病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。其中rs10981985A等位基因在≥65歲組人群中顯著減低皮質(zhì)性A

12、RC患病風(fēng)險(xiǎn)(pc=0.004,OR:0.307,95%CI:0.140-0.674),在≥65歲組人群中AA和GA基因型個(gè)體皮質(zhì)性 ARC患病風(fēng)險(xiǎn)顯著低于 GG基因型個(gè)體(pc=0.028,OR:0.320,95%CI:0.136-0.755)。
　　6.在人類晶狀體上皮組織細(xì)胞漿以及晶狀體纖維細(xì)胞內(nèi)皮質(zhì)層TDRD7廣泛表達(dá)。熒光定量PCR結(jié)果顯示在皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞TDRD7的mRNA表達(dá)與年齡呈顯著線性負(fù)相關(guān)(r

13、=-0.487,p=0.001),而將樣本依據(jù)年齡劃分為兩組,≥65歲組的皮質(zhì)性 ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞 TDRD7的 mRNA表達(dá)水平顯著低于<65歲患者(p=0.019)。在顯性、隱性、等位基因型遺傳模式下分析rs10981985位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性是否影響皮質(zhì)性 ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞 TDRD7的 mRNA表達(dá),結(jié)果提示 AA和 GA基因型的皮質(zhì)性 ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞 TDRD7基因 mRNA表達(dá)高于 GG基因型皮質(zhì)性A

14、RC患者(p=0.001)。
　　7.HSPB1在人類晶狀體上皮細(xì)胞漿以及晶狀體纖維細(xì)胞內(nèi)皮質(zhì)層廣泛表達(dá)。在顯性、隱性、等位基因型遺傳模式下分析rs10981985位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性是否影響皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞HSPB1的mRNA及蛋白表達(dá),結(jié)果顯示AA基因型皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞HSPB1基因mRNA(p=0.006)及蛋白表達(dá)(p=0.045)低于攜帶GG和GA基因型皮質(zhì)性ARC患者。
　　8.CRYB

15、B3基因在皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞的mRNA表達(dá)與年齡呈線性負(fù)相關(guān)(r=-0.337,p=0.031)。而將樣本依據(jù)年齡劃分為兩組,結(jié)果提示<65歲組的晶狀體上皮細(xì)胞CRYBB3蛋白表達(dá)高于≥65歲組表達(dá)(p=0.001)。在顯性、隱性、等位基因型遺傳模式下分析rs10981985位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性是否影響皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞CRYBB3mRNA和蛋白表達(dá),結(jié)果顯示rs10981985位點(diǎn)未影響皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮

16、細(xì)胞CRYBB3基因mRNA(p>0.05)及蛋白表達(dá)(p>0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1. TDRD7基因的rs10981985位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性在中國重慶地區(qū)漢族人群尤其是在≥65歲人群與ARC尤其是皮質(zhì)性ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān),且突變A等位基因?yàn)?ARC發(fā)病的保護(hù)因素,其機(jī)制可能為起保護(hù)效應(yīng) A等位基因通過維持較高的TDRD7mRNA表達(dá)水平從而降低ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。
　　2.rs10981985單核苷酸多態(tài)