普羅布考保護(hù)血管舒張功能及其對平滑肌細(xì)胞表型的影響.pdf

1、第一部分:Probucol通過促進(jìn)eNOS活化保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的降低
　　背景:
　　普羅布考(Probucol，PB，又名丙丁酚)是一種人工合成的抗氧化劑。它作為一種雙酚類化合物，具有降低膽固醇、抗氧化、抗炎及抗動脈粥樣硬化等多重作用，最初是作為降脂藥物應(yīng)用于臨床。臨床試驗、動物及體外實驗發(fā)現(xiàn)probucol對某些病理改變下血管收縮舒張功能有直接作用，并證實其對血管功能的作用獨(dú)立于其降脂效果。氧化應(yīng)

2、激是高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)病機(jī)制，氧化應(yīng)激通過作用于血管細(xì)胞，從而影響血管的收縮和舒張活性。而probucol的抗氧化性不僅表現(xiàn)在抑制脂質(zhì)（如低密度脂蛋白LDL）的氧化，也可以清除血液和組織中自由基，這提示probucol的抗氧化作用是否是其影響氧化應(yīng)激下血管功能改變的機(jī)制，以及是否對于心血管疾病的血管舒縮功能有保護(hù)作用。
　　血管內(nèi)皮是維持血管穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)者。已知內(nèi)皮細(xì)胞是血管收縮和舒張活性的重要組成部分，而內(nèi)皮

3、功能障礙可以導(dǎo)致血管收縮及舒張功能平衡紊亂，血壓調(diào)節(jié)異常;此外內(nèi)皮細(xì)胞受損還可以導(dǎo)致血液細(xì)胞黏附增加，炎癥細(xì)胞浸潤血管以及促-抗凝血平衡失調(diào)等。臨床試驗證實內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是心血管事件的危險因素之一。而氧化應(yīng)激對血管性疾病的發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用，活性氧族(reactive oxygenspecies，ROS)首先破壞內(nèi)皮細(xì)胞功能，影響內(nèi)皮的調(diào)壓、抗凝及內(nèi)分泌合成功能，這可能是動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等血管病變的原因之一。
　　目

4、的:
　　Probucol多效性作用機(jī)制尚不明確，而且probucol對血管舒縮功能的作用仍有爭議。本實驗為了探討probucol對血管收縮及舒張功能的作用;并根據(jù)probucol的抗氧化特性進(jìn)一步探討，在H2O2誘導(dǎo)氧化損傷基礎(chǔ)下probucol對血管舒張功能的影響及作用機(jī)制。
　　方法:
　　使用大鼠離體胸主動脈血管環(huán)構(gòu)建H2O2損傷內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的模型。(1)使用myograph技術(shù)研究離體血管環(huán)的收縮及

5、舒張功能，使用高鉀(KCl)、去氧腎上腺素(PE)分別誘導(dǎo)血管收縮反應(yīng)，乙酰膽堿(ACh)、硝普鈉(SNP)誘導(dǎo)血管舒張反應(yīng)（內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性）。觀察血管在H2O2的持續(xù)作用下，血管基礎(chǔ)功能的變化情況。(2)在H2O2作用的基礎(chǔ)上，myograph檢測PB干預(yù)處理對血管功能的影響，并且使用western blot技術(shù)檢測干預(yù)后血管環(huán)內(nèi)皮特異性一氧化氮合酶(eNOS)蛋白的表達(dá)情況，探討PB對血管環(huán)舒張功能的作用是否是通過影響內(nèi)皮

6、細(xì)胞eNOS的產(chǎn)生來實現(xiàn)的。(3)使用血管環(huán)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)一步探討PB對不良應(yīng)激下內(nèi)皮依賴性舒張功能的作用，myograph檢測培養(yǎng)后血管環(huán)活性的改變。
　　建立apoE-/-動脈粥樣硬化小鼠模型，在體實驗研究在動脈粥樣硬化疾病血管損傷基礎(chǔ)上PB對血管舒張功能的影響，及其對血脂代謝的作用與血管功能改變的相關(guān)性
　　培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），同樣在體外實驗中建立H2O2損傷血管內(nèi)皮功能的模型，主要進(jìn)行以下實驗:

7、(1)HUVECs的培養(yǎng)及鑒定;(2)實時熒光定量RT-qPCR及western blot檢測PB對內(nèi)皮細(xì)胞eNOS mRNA、蛋白表達(dá)水平的影響，對eNOS活化程度的影響;(2)在H2O2損傷情況下，PB對內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)水平的作用，探討PB是否通過影響eNOS表達(dá)來保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能;(3)免疫熒光顯微鏡觀察以及熒光定量檢測HUVEC在H2O2誘導(dǎo)氧化損傷時NO的生成，以及PB對NO產(chǎn)生的作用，探討PB是否能激活eNOS-NO生成

8、途徑達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮介導(dǎo)舒張功能的作用。
　　結(jié)果:
　　1.H2O2在一定濃度及作用時間下可以誘導(dǎo)氧化損傷，選擇性抑制大鼠離體胸主動脈血管環(huán)ACh誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能，對血管收縮功能無明顯作用。高濃度或長時間H2O2作用可以造成不可逆的血管收縮及舒張功能的喪失。
　　2.在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激下，PB（5-20μM）保護(hù)大鼠及小鼠離體胸主動脈血管環(huán)ACh誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能。
　　3.PB通過抑制H2

9、O2誘導(dǎo)的離體血管環(huán)eNOS活性下降，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，但對收縮功能無顯著作用。
　　4.在組織培養(yǎng)過程中，PB對大鼠胸主動脈血管環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒張功能也有保護(hù)作用。
　　5.在apoE-/-動脈粥樣硬化小鼠模型中，PB可以保護(hù)小鼠主動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能，且該作用與其降脂效果無關(guān)。
　　6.PB可以提高人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中p-eNOS/eNOS比值，促進(jìn)eNOS的磷酸化程度(Ser-1177)，激活eNOS氧化活性;H

10、2O2抑制eNOS總蛋白表達(dá)水平，PB保護(hù)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷情況下eNOS的磷酸化水平。
　　7.PB促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS活化的產(chǎn)物NO的產(chǎn)生。
　　結(jié)論:
　　PB對于H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是PB通過促進(jìn)eNOS磷酸化，激活eNOS氧化酶活性，從而促進(jìn)NO的生成有關(guān)。
　　第二部分:普羅布考對平滑肌細(xì)胞表型的作用及其與平滑肌細(xì)胞增殖遷移的關(guān)系
　　背景:

11、r>　　血管平滑肌細(xì)胞VSMCs作為血管壁的重要構(gòu)成部分，其功能的異常與心血管疾病有密切關(guān)系。VSMCs增殖及合成作用參與動脈粥樣硬化斑塊的形成，平滑肌細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞是斑塊的細(xì)胞成分之一。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為平滑肌細(xì)胞具有收縮型及合成型兩種表型，而病理改變與合成/增殖型有關(guān)。而新觀點(diǎn)認(rèn)為病變血管周圍或血液來源的干細(xì)胞才是斑塊形成的主要細(xì)胞來源，它們擁有部分SMC表型標(biāo)記，但不同于普通平滑肌細(xì)胞的功能，擁有更多干細(xì)胞的特性，因此提出這種多能干細(xì)

12、胞性的平滑肌細(xì)胞是SMC參與血管病理改變的基礎(chǔ)。因此SMC干細(xì)胞活性增加與血管病灶處SMC增殖或合成作用有關(guān)，主要以高分化平滑肌細(xì)胞收縮蛋白的降低(包括α-actin、SM22、calponin及SM-MHC(SM1、SM2)以及干細(xì)胞標(biāo)志升高。
　　動物實驗發(fā)現(xiàn)probucol可以抑制家兔主動脈球囊擴(kuò)張損傷后血管再狹窄，抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，抑制內(nèi)膜增厚、管腔變窄，并且改善血管重構(gòu)。因此我們從SMC對血管疾病的作用機(jī)理和表型

13、變化出發(fā)，探討PB的對心血管疾病的保護(hù)作用是否與SMC表型有關(guān)，及其對SMC增殖遷移的作用。
　　目的:
　　探索probucol對平滑肌細(xì)胞增殖及遷移的作用以及該作用是否與平滑肌細(xì)胞的表型變化有關(guān)。
　　方法:
　　(1)使用組織塊貼壁法提取并培養(yǎng)原代大鼠的血管平滑肌細(xì)胞，使用免疫熒光染色鑒定原代VSMCs。觀察原代細(xì)胞提取和培養(yǎng)過程中細(xì)胞形態(tài)及增殖分化過程，使用PB干預(yù)血管組織塊以觀察細(xì)胞從組織塊原位的遷出情

14、況;并且在細(xì)胞接種過程中直接計數(shù)PB對細(xì)胞增殖數(shù)目的影響。
　　(2)使用Transwell細(xì)胞遷移實驗檢測PB及oxLDL對VSMCs的遷移影響
　　(3)采用RT-qPCR技術(shù)、western-blot技術(shù)研究VSMCs中表型相關(guān)蛋白α-actin、SM22、干細(xì)胞標(biāo)志Sox-10的表達(dá)變化，以及平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子myocardin的表達(dá)改變情況。
　　結(jié)果:
　　(1)α-actin+SM22+Sox-

15、10-是高分化VSMCs的表型特征;
　　(2)PB單獨(dú)作用抑制VSMCs干細(xì)胞標(biāo)志Sox-10的表達(dá)，也抑制myocardin、SM22表達(dá)，但不影響收縮蛋白α-actin的表達(dá)。H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激促進(jìn)Sox-10表達(dá)并下調(diào)myocardin表達(dá)，而PB可以部分逆轉(zhuǎn)該變化，即H2O2作用基礎(chǔ)上PB抑制Sox-10，促進(jìn)myocardin表達(dá)。
　　(3)PB抑制VSMCs從組織內(nèi)遷移以及在體外培養(yǎng)過程中的遷移及增殖速率。