鎂及鎂合金可溶性降解產(chǎn)物對血管平滑肌細胞表型的影響.pdf

1、正常生理狀態(tài)下，血管平滑肌細胞(VSMC)為增殖低、合成低的收縮型表型。當血管微環(huán)境發(fā)生異常時（如動脈粥樣硬化），收縮型VSMC向多種表型方向轉(zhuǎn)變。血管支架的植入是治療動脈粥樣硬化主要方法之一，鎂基金屬材料因其優(yōu)越的機械特性和生物安全性，成為新一代血管支架的代表材料。但是因鎂的快速降解而導致降解產(chǎn)物的大量產(chǎn)生顯著影響血管微環(huán)境、進而影響血管組織細胞（尤其是VSMC）。以往關(guān)于鎂降解產(chǎn)物對VSMC影響的研究多集中于對細胞活力、增殖及凋亡的

2、考察，忽略了對其表型轉(zhuǎn)變的作用。鑒于VSMC顯著的可塑性及不同表型VSMC均不同程度上參與了動脈斑塊的形成和發(fā)展的事實，本文以純鎂及AZ31鎂合金的浸提液同收縮型血管平滑肌細胞進行共培養(yǎng)，從細胞及分子水平上考察了鎂基金屬可溶性降解產(chǎn)物對VSMC表型轉(zhuǎn)變的影響、并對介導表型轉(zhuǎn)變的可能機制進行了初步探索。
　　首先，本文改進膠原酶、胰肽酶復合酶二步法消化、建立了一種大鼠的胸主動脈收縮型血管平滑肌細胞的分離制備方法。該方法操作簡捷易行、

3、重復性好，所得細胞活力佳、純度高，并且細胞的收縮表型特征顯著。
　　其次，取含20％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基對純鎂及AZ31鎂合金分別進行一天和三天的浸提，獲得四種浸提液。通過對材料進行SEM、極化曲線和EIS以及對浸提液進行離子含量及pH的測定，考察純鎂及AZ31鎂合金在含20％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中的腐蝕行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)純鎂的腐蝕速率大于AZ31鎂合金;腐蝕過程中均產(chǎn)生了大量的可溶性Mg2+，AZ31鎂合金腐蝕后

4、pH值大于純鎂;但純鎂腐蝕呈層片狀，時間越長，片層越光滑細膩，AZ31鎂合金主要為點腐蝕，時間越長，腐蝕坑越大，越不均一。
　　隨后，取四種浸提液、按照不同稀釋比例處理收縮型血管平滑肌細胞，考察細胞增殖、遷移和凋亡行為的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純鎂浸提液所可顯著促進共培養(yǎng)的血管平滑肌細胞的的生長，細胞的增殖、遷移均增強，而凋亡被抑制;浸提時間、浸提液所占比例與這些細胞的這些反應(yīng)呈正相關(guān)。AZ31的浸提液輕微的抑制了血管平滑肌細胞的增殖與遷

5、移。
　　進一步采用ICC、QRT-PCR、WB分析手段，考察浸提液對共培養(yǎng)的收縮型VSMC的基因表型的影響。結(jié)果表明，兩種材料的浸提液處理后，細胞中Myh11、a-SMA、Smtn、Sm22a等收縮型VSMC的表型基因的表達水平均明顯下降，且下降幅度依賴浸提時間和浸提液比例的變化，表明鎂基金屬材料的可溶性降解物削弱血管平滑肌細胞維持收縮型性狀的能力;反之，一系列炎性細胞的表型基因(包括表面黏附分子Vcam1和炎性細胞因子ILIB

6、、趨化因子Ccl2、Ccl20)的表達水平整體上調(diào)，表明經(jīng)過浸提液處理后血管平滑肌細胞炎性表型特征明顯增強。
　　比較兩種鎂基金屬材料浸提液后，本文采用MgSO4配制的(2.5、5、25、50) mmol/L含20％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基處理收縮型表型的血管平滑肌細胞，考察Mg2+對細胞收縮型標記基因和蛋白以及炎癥表型基因的影響。結(jié)果表明隨著Mg2+含量的增加，VSMC收縮型分子標記基因的表達降低而炎性表型的分子標記基因的

7、表達增強。說明鎂基金屬腐蝕釋放的可溶性Mg2+可能部分介導了VSMC從收縮型向炎性表型轉(zhuǎn)變的發(fā)生。
　　最后，本文分析了浸提液和單一鎂離子添加對共培養(yǎng)的收縮型VSMC中兩個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Myocardin及Klf4表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VSMC收縮型性狀基因的促進性調(diào)控因子Myocardin的mRNA和蛋白水平均隨著處理時間下降、且和處理濃度相關(guān);而抑制性的轉(zhuǎn)錄因子Klf4的表達則被顯著提高。說明鎂基金屬腐蝕釋放的鎂離子可引起兩