過(guò)量全反式視黃酸在小鼠腭裂誘發(fā)中對(duì)軟骨分化的影響及作用機(jī)制.pdf

1、背景與目的:
　　 腭裂是一種常見出生缺陷,其發(fā)生有遺傳因素,也有環(huán)境因素。遺傳因素僅占10％-25％,多數(shù)是由環(huán)境.遺傳相互作用而誘發(fā)的。在腭器官發(fā)育過(guò)程中,間充質(zhì)細(xì)胞軟骨分化異常及增殖異常是導(dǎo)致腭裂發(fā)生的重要因素之一。全反式視黃酸(all-trans Retinoic acid,atRA)是維生素A(Vitamin A,VitA)的氧化代謝產(chǎn)物,也是VitA的生理活性形式。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,VitA缺乏或過(guò)

2、量均可誘發(fā)腭裂。TGFβ是一組細(xì)胞因子,對(duì)于哺乳動(dòng)物腭器官發(fā)育起著重要調(diào)節(jié)作用,其基因缺陷型仔鼠全部存在腭裂。atRA可影響多種組織細(xì)胞分泌TGFβ,在胚胎間充質(zhì)組織分化過(guò)程中,高劑量atRA可引起內(nèi)源性TGFβ1以及TGFβ受體Ⅱ表達(dá)水平降低,并抑制長(zhǎng)骨發(fā)育中的軟骨形成。哺乳動(dòng)物上腭是骨性器官,atRA是否能夠通過(guò)TGFβ／Smads信號(hào)而影響腭器官發(fā)育中的軟骨形成,目前尚不清楚。本次研究通過(guò)觀察藥理劑量的atRA對(duì)腭間充質(zhì)細(xì)胞軟骨分

3、化的影響,及其對(duì)TGFβ／Smads信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)作用,探討atRA誘發(fā)腭裂的作用機(jī)制,為腭裂預(yù)防提供理論指導(dǎo)。
　　 方法:
　　 本研究分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)兩部分。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分兩組,每組6只孕鼠,在小鼠孕11天(GD11),實(shí)驗(yàn)組連續(xù)3天給予atRA灌胃(80mg／kg·d-1),對(duì)照組以同樣的方法給予等量的食用油。在GD18處死孕鼠,取出胎鼠,觀察atRA的胚胎發(fā)育毒性,及其對(duì)腭器官發(fā)育的影響。體外實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)

4、的方法,對(duì)GD12胎鼠腭間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行高密度微團(tuán)培養(yǎng),在軟骨分化過(guò)程中,觀察atRA對(duì)軟骨分化的影響,及其對(duì)TGFβ1和Smads表達(dá)激活的影響。用阿爾新藍(lán)定量染色法檢測(cè)糖胺聚糖含量,以分析腭間充質(zhì)細(xì)胞的軟骨分化情況；用western blot檢測(cè)TGFβ1和Smads蛋白表達(dá)及磷酸化水平。采用SPSS12.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多樣本均數(shù)比較采用方差分析,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比較用Dunnet-t檢驗(yàn),分類變量資料采用x2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)

5、α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,atRA組仔鼠畸形發(fā)生率46.4％,對(duì)照組為5.8％,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=28.990,P<0.05)；atRA組致死胎鼠率為7.2％,對(duì)照組為0％,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；atRA組仔鼠腭裂發(fā)生率59.5％,對(duì)照組為1.5％,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=17.374,P<0.05)。胎鼠腭間充質(zhì)細(xì)胞軟骨分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在0.1-5.0μM濃度